编号：YYHY00937

篇名：刺状硅酸铜空心微球的催化抗菌性能研究及其在口腔感染性疾病治疗中的应用

作者： 刘小灿

关键词： 类Fenton反应; 口腔感染性疾病; 牙周炎; 抗菌治疗; 刺状微球;

机构： 吉林大学

摘要： 研究背景: 口腔是人体细菌的主要栖息地之一。研究表明,口腔中细菌数量庞大,约700多种。在正常情况下,口腔中的细菌与宿主之间相互作用,共同维持口腔生态平衡;当细菌-宿主间平衡被打破时,则会导致一系列口腔感染性疾病。此外,口腔细菌可沿胃肠道、血液等途径扩散,引发全身性疾病。因此,抑制致病菌、调节口腔菌群对于口腔感染性疾病的治疗和全身健康的维护具有重要意义。目前,针对牙周炎与口腔感染性伤口等口腔感染性疾病的治疗方法主要包括机械除菌疗法和抗生素疗法。然而,这些传统的治疗手段有时不能彻底清除口腔致病菌,还会导致细菌耐药性增加、菌群紊乱等副作用。因此,开发能够克服细菌耐药性、维持菌群平衡的新型抗菌剂是当前医学领域的重要需求。 近年来,化学动力学疗法作为一种新兴治疗方法,被广泛应用于生物医学领域。在抗菌领域,化学动力学疗法可利用具有Fenton/类Fenton反应催化活性的微纳材料,催化H2O2生成·OH,攻击细菌的细胞结构,致使细胞破裂死亡,从而实现杀菌效果。尽管化学动力学疗法具有广泛的研究前景,但仍存在一些缺陷限制了其应用。第一,微纳催化剂产生的·OH寿命极短、扩散距离有限,只能对极近距离的细菌造成损伤。第二,口腔液体环境会干扰抗菌剂的附着,使其难以长时间停留在作用部位,进而影响抗菌效果。第三,微纳催化剂在体内环境中可能会释放出机体不存在的外来金属离子和有机成分,从而引起潜在毒性。面对这些挑战,开发具有高效催化杀菌能力、强大细菌靶向能力和良好生物安全性能的新型抗菌剂至关重要。 加强材料与细菌的结合力可以极大地增加细菌周围微纳材料的数量,并通过原位杀灭病原体来提高现有微纳系统的抗菌效果。例如,带正电的抗菌剂可以靶向带负电的病原体膜进行杀菌。此外,特殊官能团、抗体、核酸适配体或靶向肽修饰的微纳系统对致病菌具有极高的亲和力。但是,上述策略往往涉及复杂的合成步骤,更重要的是,即使可以缩短微纳材料与细菌之间的距离,微纳材料也不能完全嵌入细菌膜中,因此不能最大程度地降低体系对·OH的淬灭作用。自然界中存在许多具有抗菌作用的天然微纳结构,例如,蝉翼的尖刺结构赋予其更容易与细菌结合的特性,甚至可以通过物理穿刺作用杀死部分细菌。上述研究为抗菌材料的设计提供了仿生学参考。值得说明的是,具有强大细菌结合能力、高效类Fenton杀菌能力和良好生物安全性的刺状材料的相关研究目前比较少见,其在口腔感染性疾病治疗方面的医学应用更鲜有报道。 研究目的: 本研究制备了一种刺状硅酸铜空心微球（Copper Silicate Hollow Spheres,CSHSs）,并探究其作为新型抗菌剂在口腔伤口感染和牙周炎等口腔感染性疾病治疗中的应用。 研究方法: 1.通过水热法合成了CSHSs,并对其理化性质进行了表征。具体方法如下:（1）通过扫描电子显微镜观察CSHSs的形貌和粒径大小。（2）通过透射电子显微镜及能量色散光谱仪观察CSHSs的形貌、粒径大小和元素分布。（3）通过X射线光电子能谱仪分析CSHSs的表面元素分布与价态。（4）通过X射线衍射仪表征CSHSs的晶相结构。（5）通过傅里叶变换红外光谱仪表征CSHSs的官能团和相关基团。（6）通过Zeta电位仪分析CSHSs的电势。 2.对CSHSs+H2O2体系的类Fenton反应催化活性、催化机理和稳定性进行了研究。具体方法如下:（1）以TMB,ABTS和OPD为显色底物,探究CSHSs+H2O2体系的类Fenton反应催化活性。（2）通过改变p H值、温度和底物浓度,探究反应条件对催化活性的影响。（3）通过计算Km和Vmax等参数探究酶促反应动力学。（4）通过电子自旋共振仪检测催化过程中·OH的生成。（5）通过密度泛函理论模拟类Fenton反应历程。（6）通过CSHSs与H2O2共孵育过夜并检测其结构性质和酶活性,验证其稳定性。 3.通过体内外实验,对CSHSs的生物安全性进行了研究。具体方法如下:（1）通过CCK-8法检测CSHSs对L929小鼠成纤维细胞和大鼠骨髓间充质干细胞的毒性。（2）通过细胞活-死染色法直观检测CSHSs对L929小鼠成纤维细胞和大鼠骨髓间充质干细胞活力的影响。（3）通过溶血实验和凝血实验探究CSHSs的血液相容性。（4）通过小鼠给药后的持续观察和检测探究CSHSs的体内毒性。 4.以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌为研究对象,对CSHSs+H2O2体系的体外抗菌能力进行了研究。具体方法如下:（1）通过液体培养相对存活率检测和固体培养菌落计数实验,评价体系的抗菌效果。（2）通过细菌活-死染色实验,可视化观察体系的抗菌效果。（3）通过扫描电子显微镜观察,探究体系对细菌形态的影响。（4）以DCFH-DA为探针,检测不同处理后细菌的胞内活性氧含量。 5.对CSHSs+H2O2体系的抗菌机制进行了研究。具体方法如下:（1）通过丁达尔效应、光学、荧光和扫描电子显微镜观察,探究CSHSs对细菌的结合能力。（2）通过分子动力学模拟,探究CSHSs对细菌的结合过程。 6.建立了地鼠口腔感染性伤口模型,对CSHSs+H2O2体系的体内抗菌治疗效果进行了探究。具体方法如下:（1）通过计算伤口愈合率,评估体系的治疗效果。（2）通过细菌平板培养,评估体系的抗菌性能。（3）通过H&E染色、Masson染色、免疫组化染色和免疫荧光染色（TNF-α、IL-1β、TGF-β、IL-10、VEGF、CD86、CD206和DHE）,对治疗效果进行组织病理学分析。（4）通过白细胞和超敏C反应蛋白水平检测,评估各组实验动物全身炎症的发展程度。 7.建立了大鼠牙周炎模型,对CSHSs+H2O2体系的体内抗菌治疗效果进行了探究。具体方法如下:（1）通过micro-CT扫描,评估体系的治疗效果。（2）通过细菌平板培养,评估体系的抗菌性能。（3）通过H&E染色、Masson染色、免疫组化染色和免疫荧光染色（TNF-α、IL-1β、TGF-β、IL-10、VEGF、CD86、CD206、Runx2和OCN）,对治疗效果进行组织病理学分析。（4）通过16S r RNA测序,探究治疗体系对口腔菌群的影响。 研究结果: 1.成功合成了CSHSs。CSHSs平均粒径约为440 nm,带负电荷,主要元素为Si、O、Cu,其中Cu几乎均以Cu2+形式存在。 2.CSHSs在弱酸条件下具有较高的类Fenton催化活性,催化活性与温度和底物浓度正相关。CSHSs对H2O2的亲和力较高,类Fenton反应活性位点是Cu,反应过程存在Cu+/Cu2+循环。 3.CSHSs无明显细胞毒性,且对溶血率、凝血酶原时间和凝血酶时间无明显影响。多种途径给药后的小鼠体重、血液学、血液生化和主要脏器H&E染色未见明显异常。 4.CSHSs+H2O2体系在体外实验中能够有效杀菌,其杀菌效果与活性氧有关。CSHSs的刺状结构能够增强其与细菌的结合性。 5.CSHSs+H2O2体系在体内实验中能够有效杀菌,促进口腔感染伤口愈合,降低牙周炎组织破坏程度。组织病理学分析表明,CSHSs+H2O2体系可以通过抗菌作用降低炎症因子的表达。 研究结论: 本研究成功合成了CSHSs,并将其作为多功能抗菌剂,用于口腔感染性疾病的治疗。CSHSs的类Fenton反应活性使其能够催化H2O2产生·OH进行杀菌。此外,CSHSs的刺状表面使其能够与细菌紧密结合,最大限度地缩短与细菌的作用距离,从而增强催化杀菌效果。体内实验进一步证明CSHSs+H2O2体系能够有效清除细菌,减轻炎症反应,加速组织修复。