研究背景与目的 免疫检查点阻断疗法（ICIs）通过阻断肿瘤表面抑制性受体与淋巴细胞表面的配体结合,阻断肿瘤细胞的免疫逃逸,激活淋巴细胞发挥抗肿瘤作用。该疗法在黑色素瘤、肺癌等癌症的治疗中已经显示出持久的抗肿瘤效果,但是在结直肠癌（CRC）中的治疗效果并不理想,将免疫检查点阻断疗法与别的治疗方法联用为提高结直肠癌患者的生存率带来新的希望。PI3K/AKT/mTOR信号通路调控肿瘤细胞的分裂、增殖,参与新陈代谢、肿瘤血管生成等过程。PI3K通路的异常激活发生在大多数实体瘤中,PIK3CA突变型结直肠癌患者复发风险高,预后不良,生存期较差。使用PI3K通路靶向抑制剂（PI3Ki）能将患者的复发率由30%降低到10%。将PI3K通路靶向抑制剂与免疫疗法联用的临床试验正在开展中,但由于PI3Ki对淋巴细胞的毒性作用为二者的联用提出了一定的挑战。因此利用纳米载药系统将PI3Ki靶向输送到肿瘤细胞内部,规避PI3Ki对淋巴细胞的毒性对实现靶向治疗与免疫检查点阻断疗法协同治疗结直肠癌具有重要意义。 实验方法与结果 1、PI3K/mTORi抑制肿瘤细胞生长的同时也会通过影响淋巴细胞PI3K/AKT/mTOR通路抑制淋巴细胞的增殖 PI3K/mTORi在用于肿瘤治疗时也会抑制淋巴细胞的正常增殖,影响免疫系统发挥正常的功能。本实验中,我们用不同浓度（0、0.0001、0.001、0.01、0.1、1μM）的PI3K/mTORi（BEZ235）处理结直肠癌细胞（CT26、MC38、HCT116）和淋巴细胞（EL4、Jurkat）72 h后,通过MTT检测药物对它们生长的影响。结果显示,BEZ235对肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC50)在0.1μM左右,而淋巴细胞的IC50在0.01μM左右,说明淋巴细胞对BEZ235更为敏感。与此同时,我们还利用CFSE染色小鼠脾淋巴细胞,利用流式细胞仪检测CD8+T细胞的增殖情况,结果显示,BEZ235能明显抑制淋巴细胞的增殖能力,且随着药物浓度上升,淋巴细胞几乎失去了分裂增殖的能力。为了进一步验证BEZ235抑制肿瘤细胞和淋巴细胞生长的机制,我们通过免疫印迹法分析了不同浓度（0、0.0001、0.001、0.01、0.1、1μM）的BEZ235处理结直肠癌细胞（CT26、MC38、HCT116）和淋巴细胞（EL4、Jurkat）3 h后,对PI3K通路下游蛋白AKT、S6和4EBP1以及mTOR激酶磷酸化的影响。结果显示BEZ235在0.1μM时显著抑制肿瘤细胞和淋巴细胞AKT、S6、4EBP1以及mTOR蛋白的磷酸化水平。 2、构建pH可控、靶向肿瘤细胞的载PI3K/mTORi介孔二氧化硅纳米颗粒 为了规避BEZ235对淋巴细胞的毒性,我们设计了一种pH响应的能靶向肿瘤细胞的介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNP-PAA-PEG-iRGD）。聚丙烯酸（PAA）是一类亲水性的聚合物,能够响应pH的变化,作为封堵“阀门”使药物装载在纳米颗粒孔道内,在肿瘤酸性环境中释放出来。聚乙二醇（mPEG）具有良好的生物相容性,常用于修饰纳米颗粒,使纳米颗粒在机体内不被巨噬细胞等清除。iRGD是肿瘤血管靶向肽,修饰在纳米颗粒表面使纳米颗粒能够更好地靶向肿瘤细胞。MSNP-PAA-PEG-iRGD的具体合成方法如下:首先利用溶胶凝胶法合成了模板化的介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNP）;然后将BEZ235/FITC装载在MSNP孔道内,利用MSNP-NH2表面的氨基在水溶液中电离与聚丙烯酸（PAA）上的羧基发生静电吸附反应,将PAA修饰在MSNP-NH2表面,封堵孔道,合成MSNP-PAA;最后,利用酰化反应将氨基化的聚乙二醇（NH2-mPEG）和iRGD偶联在MSNP-PAA表面,合成MSNP-PAA-PEG-iRGD。同时,我们在合成过程中通过激光粒度分析仪（DLS）检测纳米颗粒的粒径,通过扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）监测纳米颗粒的内外部结构,通过氮气吸附脱附仪检测纳米颗粒的孔径大小,通过傅里叶红外光谱仪（FTIR）对纳米颗粒表面聚合物进行表征。3、MSNP-PAA-PEG-iRGD的体内外生物分布 为了研究MSNP-PAA-PEG-iRGD特异性靶向肿瘤细胞的功能,我们将载FITC的MSNP-PAA-PEG-iRGD（MSNP-FITC）与肿瘤细胞（CT26、MC38、HCT116）和淋巴细胞（EL4、Jurkat）共孵育,利用流式细胞仪和共聚焦显微镜观察MSNP-FITC在细胞内的分布情况。给小鼠静脉注射MSNP-FITC,动物活体成像仪观察MSNP-FITC在小鼠体内分布情况。结果显示,纳米颗粒在体外能特异性靶向肿瘤细胞,在体内也能在肿瘤部位聚集,说明我们合成的纳米颗粒具有良好的肿瘤靶向性。 4、MSNP-BEZ235在体外保护淋巴细胞的增殖 为了研究载BEZ235的MSNP-PAA-PEG-iRGD（MSNP-BEZ235）在体外对肿瘤细胞和淋巴细胞生物活性的影响,我们通过MTT检测了MSNP-BEZ235对肿瘤细胞和淋巴细胞生长的影响,用免疫印迹法检测了MSNP-BEZ235对肿瘤细胞和淋巴细胞PI3K/AKT/mTOR通路的影响,用CFSE检测了MSNP-BEZ235对小鼠脾淋巴细胞增殖和功能的影响。结果显示MSNP-BEZ235在体外能通过抑制肿瘤细胞PI3K通路下游蛋白AKT、S6、4EBP1和mTOR的磷酸化水平抑制肿瘤细胞的生长,其抑制效果同游离BEZ235相当。对于淋巴细胞,在同样的药物浓度下,MSNP-BEZ235能明显缓解游离BEZ235对淋巴细胞的毒性,保护淋巴细胞的增殖。 5、MSNP-BEZ235联合Anti-PD-1抑制肿瘤生长同时促进肿瘤微环境中的免疫浸润 为了进一步评估MSNP-BEZ235在体内与Anti-PD-1协同的抗肿瘤效果。我们构建了小鼠结直肠癌动物模型,检测了BEZ235、MSNP-BEZ235、Anti-PD-1、BEZ235+Anti-PD-1和MSNP-BEZ235+Anti-PD-1对小鼠肿瘤生长的抑制情况以及对肿瘤微环境中浸润淋巴细胞的影响。结果显示,MSNP-BEZ235和MSNP-BEZ235+Anti-PD-1对肿瘤的抑制效果均分别优于BEZ235和BEZ235+Anti-PD-1,说明将药物装载在纳米颗粒,药物随着纳米颗粒聚集在肿瘤部位,增加了药物在肿瘤中的浓度,对肿瘤生长的抑制效果更好。与此同时,联合给药组对肿瘤生长的抑制效果均优于游离药治疗组,说明靶向药和免疫检查点阻断疗法协同能增加抗肿瘤效果。另外,通过CD8+T细胞与凋亡细胞（Tunel）的共染,证明将PI3K/mTORi装载在纳米颗粒内部能规避淋巴细胞毒性,减少肿瘤内部淋巴细胞的凋亡。 实验结论 我们在体外验证了PI3K/mTORi对淋巴细胞生长和增殖的抑制作用,并成功构建了pH响应靶向肿瘤细胞的介孔二氧化硅纳米颗粒MSNP-PAA-PEG-iRGD;验证了MSNP-PAA-PEG-iRGD在体内外具有肿瘤特异性靶向功能;验证了MSNP-BEZ235在体外能抑制肿瘤细胞生长的同时保护淋巴细胞的增殖;验证了PI3K/mTORi与Anti-PD-1协同治疗结直肠癌;阐释了PI3K/mTORi与Anti-PD-1协同治疗结直肠癌,规避淋巴细胞毒性的机制。 ...
乳腺癌的治疗仍然存在着肿瘤选择性低,靶向性不足,易产生多药耐药等问题,功能化修饰的无机纳米载体在抗肿瘤治疗中的应用越来越受到关注,其中,多肽修饰的纳米载药体系在提高药物稳定性和肿瘤细胞靶向性等方面具有一定的优势。本课题组前期研究结果,L-K6是一种具有α-螺旋结构的阳离子抗菌肽,对乳腺癌细胞具有选择性,能够穿膜进入细胞核,并且降低耐药。若L-K6作为配体修饰构建纳米载药体系,则有望在提高药物递送靶向性及降低耐药等方面发挥重要作用。本论文将选取30nm介孔二氧化硅(mesoporous silica nanoparticle,MSN)为药物载体,装载靶向凋亡抑制基因Survivin的Sur.siRNA,阳离子聚合物PEI(Polyetherimide)连接L-K6作为配体进行修饰,构建MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6纳米载药体系,优化合成比例,进行性质表征,并对其在乳腺癌细胞中的siRNA递送效果、抗肿瘤机制和耐药逆转活性进行研究。 首先,我们在3条Sur.siRNA中选择对乳腺癌细胞Survivin基因干扰效果最佳的序列,装载构建MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6,并对纳米载药体系进行N/P的优化和性质表征。N/P是PEI中氮(N)和寡核苷酸中核苷酸磷酸盐(P)的比,我们合成了不同N/P(1:1、2:1、4:1、6:1、8:1)的MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6,N/P为6:1时,纳米粒度和Zeta电位分析仪检测到MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6的粒径最小为94.16±2.08nm;Zeta电位为33.43±0.40m V;琼脂糖凝胶电泳实验结果显示,MSN@PEI-L-K6可以结合Sur.siRNA,且保护Sur.siRNA不会被RNA酶降解,因此确定最佳合成比为N/P为6:1。热重分析实验显示,载药体系中配体PEI-L-K6的总上载量为41.50%;圆二色光谱实验显示,L-K6修饰后,MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6载药体系依然保持了该肽原有的α-螺旋二级结构;扫描电镜观察发现,载药体系外观形貌为大小均匀的圆球形,粒径约为50nm,稍有团聚,使纳米粒度仪无法检测到单个的载药体系颗粒导致粒径结果偏大;MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6在人血清中孵育96 h内,其粒径无明显变化,说明具有一定的稳定性;溶血实验结果显示,MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6浓度在40μg/m L以下时,溶血率均低于5%,较为安全。综合以上结果,优化N/P比例构建的MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6载药体系在装载、合成与性质等方面都较为稳定。 其次,我们将构建的MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6载药体系作用于人乳腺癌MCF-7、MCF-7/Adr细胞,对其Sur.siRNA递送能力和抗肿瘤机制进行研究。CCK-8法检测结果显示,N/P为6:1时,MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6载药体系对MCF-7、MCF-7/Adr细胞的抑制能力最强,IC50分别为16.79±3.82μg/m L和22.77±2.18μg/m L;膜电位和膜通透性检测结果表明,MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6载药体系以非破膜的方式进入细胞;RT-qPCR和Western-blot实验结果显示,MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6载药体系分别从蛋白水平和基因水平有效降低Survivin蛋白和Survivin基因的表达;流式细胞仪检测转染效率的实验结果显示,FAM荧光标记siRNA的MSN-FAM-siRNA@PEI-L-K6载药体系可提高FAM-siRNA的细胞转染效率,是FAM-siRNA的10倍;流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6能诱导MCF-7、MCF-7/Adr细胞发生凋亡,凋亡率分别为58.17%和55.27%;荧光酶标仪检测凋亡信号蛋白Caspase9、Caspase3活性,结果表明MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6可激活Caspase9和Caspase3。 最后,我们考察了载体MSN@PEI-L-K6对耐药乳腺癌MAF-7/Adr细胞耐药性的影响。流式细胞仪结果显示,MSN@PEI-L-K6能够有效提高化疗药阿霉素DOX(doxorubicin,DOX)在MCF-7/Adr细胞内的滞留,增加细胞对P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gP)底物Rho123的摄取,抑制外排功能,且能降低P-gP的表达,说明修饰在载体上的L-K6仍具备逆转MCF-7/Adr细胞耐药的活性。 综上所述,我们有效合成了50nm左右的MSN-Sur.siRNA@PEI-L-K6,性质较为稳定安全;可被乳腺癌MCF-7、MCF-7/Adr细胞摄取,能够有效递送siRNA进入细...
背景:目前对于深龋的修复方式及治疗药物均十分有限。由于深龋破坏同时涉及硬组织的脱矿和深层牙体组织的崩解,因此理想的深龋修复应包含硬组织的再矿化以及牙本质的修复性再生。在前期研究中,我们创新性地设计合成了釉原蛋白衍生多肽QP5,已证实其在体内外均具备良好的钙磷吸附及硬组织再矿化功能,且最新研究发现该多肽还对牙髓细胞有良好的细胞学效应。然而,由于多肽在复杂的口腔环境中易被稀释降解,难以维持药效浓度,且用于再矿化时还缺乏钙磷来源,在进一步应用时仍需对这类材料进行有效的药物复合及递送。在众多的载体中,生物活性玻璃因具有良好的钙磷储备性、界面结合性及载药释药性能,在作为各类生物活性分子的载体方面表现出明显优势。而介孔生物活性玻璃(MBG)具有充足的钙磷储备、可控的刺激响应性药物释放特征和良好的生物活性,有潜力用于QP5的搭载并与之协同在深龋发挥双效应。 目的:基于釉原蛋白衍生多肽QP5引导硬组织矿化优势和促进牙髓细胞生物矿化的潜能,借助生物活性玻璃的载药性、界面结合性及钙磷储备性,构建介孔生物活性玻璃/仿生多肽QP5复合体,检测复合体的载药释药性能,探究其对人牙髓细胞行为的影响及在体内原位修复牙本质效果,为多肽类生物大分子药物应用于深龋的双效应修复奠定理论基础。 方法: 1.采用溶胶-凝胶法制备非介孔生物活性玻璃(NBG),在此基础上结合模板法制备介孔生物活性玻璃(MBG),并通过SEM、TEM与氮气吸附实验等手段进行表征。通过Fmoc-固相肽化学方法合成并纯化QP5多肽,通过圆二色谱及高效液相色谱分析该多肽在不同p H溶液中的稳定性。分别使用两种生物活性玻璃与QP5复合,比较其包封率及载药量。进一步结合FTIR、XPS检测手段验证复合体构建成功,筛选出成功搭载QP5的复合体。 2.使用不同浓度多肽与MBG复合,通过比较包封率与载药量筛选出MBG与QP5的最佳配比。进一步分别对MBG及QP5进行电性修饰,筛选可有效提高复合体载药量的修饰方式。将复合体在不同p H(7.4、5.5、4.0)条件下进行释药,使用紫外分光光度计检测多肽释放量,通过甲基百里酚蓝法测量钙释放量,通过磷钼酸法测量磷释放量,设置短期检测节点(0～12 h)及长期检测节点(1～8 d)以观测复合体的药物释放特征。 3.体外提取人牙髓细胞,利用CCK-8实验检测MBG/QP5对h DPCs的毒性作用并筛选出最适作用浓度。采用细胞划痕实验检测梯度浓度MBG/QP5复合体对h DPCs迁移能力的影响。制备复合体包被的人牙本质样本,通过SEM观察复合体对牙本质的吸附,通过CLSM观察h DPCs对不同处理组牙本质的粘附情况。配制含MBG/QP5复合体的矿化诱导培养基并与h DPCs共培养,采用ALP染色和茜红素染色分析复合体对h DPCs碱性磷酸酶活性及矿化程度的影响。提取各实验组细胞RNA,采用实时荧光定量PCR检测h DPCs矿化相关基因(ALP,COL1,DSPP,RUNX2,OCN,OPN)转录水平的变化,评价MBG/QP5复合体诱导h DPCs成牙本质向分化效果。 4.制备FITC标记的QP5多肽与MBG/QP5复合体,分别使用激光共聚焦显微镜、流式细胞术及细胞透射电镜检测复合体入胞情况。分别使用氯丙嗪,阿米洛利,甲基-β-环糊精和4°C培养预处理细胞,检测复合体及多肽的入胞通路。在多肽及复合体入胞后移除药物,通过流式细胞术观察第2～48 h后胞内药物留存情况。 5.选择SD大鼠为实验动物,将MBG/QP5复合体应用于大鼠上颌第一磨牙,以构建用于研究复合体在体内应用效果的动物模型。监测大鼠体重,4周观察期后采集大鼠血液进行血常规、血生化分析,对肝肾行H&E染色,以评估复合体在体内应用的生物安全性。采集上颌磨牙并利用Micro-CT进行硬组织影像学分析,通过H&E染色进行牙髓及第三期牙本质形成情况的组织学分析。 结果: 1.MBG/QP5复合体成功构建及优化:成功制备了具有高度有序介孔结构与高比表面积的MBG,可通过内部有序规律介孔结构及静电吸附载入QP5;MBG/QP5复合体中保留了QP5的特征性活性基团与功能元素,证实了MBG/QP5复合体的成功构建。多肽的初始浓度影响了复合体的包封率与载药量,1.5 mg/m L的QP5初始浓度是综合载药效能与经济性价比的最适配方;调整载药体系p H至QP5等电点以下可使MBG和QP5之间产生更强的静电吸附,在维持QP5初始浓度不变的情况下进一步提高MBG/QP5复合体的载药量。 2.MBG/QP5复合体可实现p H响应性的双重药物递送:复合体的释药曲线呈先大量突释后长期缓释,其中钙磷离子在p H为4.0时具有最高释放量,而QP5在p H为7.4时具有最高释放量;酸性p H下MBG的溶解导致钙磷离子与多肽快速释放,并上调环境p H,引发QP5多肽进一步大量解离并释放,以受控的方式完成p H响应性的层级释药。 3.MBG/QP5复合体具有良好的细胞生物学效应:复合体对人牙髓细胞具有良好的细胞相容性,100μg/m L及以下浓度的复合体颗粒可用于长期的细胞培养。复合体呈时间及浓度依赖性地促进h DPCs的迁移;复合体对牙本质有良好的的亲和性,对脱矿的牙本质小管产生一定封闭作用;复合体可促进h DPCs对牙本质的粘附,并提高其碱性磷酸酶活性,诱导生物矿化结节的产生,上调细胞成牙本质向分化及矿化相关基因的表达,且效果优于相同浓度的单一成分(MBG或QP5),在牙本质-牙髓细胞界面具有良好的细胞生物学调控作用。 4.MBG/QP5复合体可被牙髓细胞主动摄取并维持多肽胞内浓度:复合体及多肽均可被h DPCs依靠ATP消耗的主动方式进行细胞摄取,其摄取呈浓度及时间依赖性。多肽通过网格蛋白介导的途径被牙髓细胞内化,并受到细胞膜脂筏调节;复合体除以上两条入胞通路外,还可以通过巨胞饮作用被摄取。移除药物后,复合体相较于单独应用多肽能更长时间维持胞内QP5浓度。 5.MBG/QP5复合体成功诱导修复性牙本质再生:成功构建MBG/QP5复合体内应用的SD大鼠直接盖髓动物模型,复合体在体内应用4周后对大鼠体重、血常规、血液生化及肝肾均无明显损害,复合体在体内应用具有良好的生物安全性。复合体在穿髓孔处成功诱导了规则的桥梁状修复性牙本质层,对穿髓孔形成物理和生物双重封闭,保护了深部的牙髓组织。 结论:利用具有有序介孔的MBG及修饰表面电性的QP5可成功制备具有深龋修复双效应潜能的MBG/QP5复合体,此复合体弥补了单独应用多肽时钙磷来源不足、界面封闭性差的缺陷,并可在酸性环境实现p H响应性的双重药物递送。MBG/QP5复合体可促进牙髓细胞迁移与粘附,调控细胞成牙本质向分化,在体内原位诱导修复性牙本质再生。此复合体的构建为蛋白多肽类生物大分子药物递送提供了技术参考,同时也为深龋的仿生修复提供了新策略,未来有望在深龋的临床防治中发挥优异的生物学潜能。 ...
背景:龋病是发生于牙齿硬组织的慢性进行性的感染性疾病。变异链球菌（S.mutans）被证明是口腔中主要的致龋菌,具有产酸、耐酸和形成生物膜的能力。变异链球菌以环境中的蔗糖为底物所合成的胞外多糖（EPS）是生物膜的主要成分及重要的致龋毒力因子。因此,靶向干扰胞外多糖的合成有望成为防治龋病的有效手段。 Vic RK是变异链球菌必需双组份信号转导系统（TCSTS）,与变异链球菌的EPS合成和粘附力有关。本课题组前期研究中发现了一条非编码反义RNA分子能够抑制vicR的表达,并将其命名为antisense vicR RNA（ASvicR）。此外,ASvicR被证实可有效干扰vicR的表达,抑制EPS的合成,妨碍生物膜的形成,从而降低变异链球菌致龋性。这些研究结果表明ASvicR有望成为龋病早期防治的靶向生物分子。课题组前期已成功构建含ASvicR序列的重组质粒（plamid-ASvicR,pASvicR）,但裸露的pASvicR易被核酸酶水解,若想实现其临床应用转化,需构建一种能够负载和保护重组质粒并促进其转化的载体。 树枝状介孔二氧化硅纳米粒（DMSNs）因其具有放射状大孔道结构,较大的比表面积和孔隙率,较好的入胞性能和生物可降解性,能够携载空间位阻较大的生物学分子如蛋白质、核酸等,在药物传递系统中有着极大的优势。DMSNs表面富含羟基使得其表面带负电荷,为了负载表面同样带负电荷的核酸分子,需对DMSNs表面进行氨基化改性而使其带正电荷。 目的: 1.合成并改性DMSNs以得到氨基化树枝状介孔二氧化硅纳米粒（DMSNs-NH2）。 2.探究DMSNs-NH2负载、保护以及递送pASvicR的能力;并探究DMSNs-NH2负载pASvicR后（DMSNs-NH2-pASvicR）的细胞毒性。 3.探究DMSNs-NH2-pASvicR对变异链球菌致龋性的调控作用。 方法: 1.使用水油双相分层法合成DMSNs后对其进行氨基修饰得到DMSNs-NH2;利用能谱仪（EDS）配合透射电镜（TEM）、氮气吸-脱附测试、纳米粒度电位仪等对纳米颗粒进行表征。 2.通过绘制负载曲线、琼脂糖电泳、DNase I酶切保护实验、Zeta电位测试以及EDS面扫来分析DMSNs-NH2负载和保护pASvicR的能力;利用抗性平板筛选和GFP表达实验来验证DMSNs-NH2递送pASvicR进入变异链球菌的能力;通过CCK-8和死活细胞染色评估DMSNs-NH2-pASvicR对人牙龈成纤维细胞（HGFs）的细胞毒性。 3.利用扫描电镜（SEM）观察各组生物膜形态结构;利用激光共聚焦显微镜（CLSM）分析各组生物膜EPS量和菌量以及两者间的比例;通过实时荧光定量聚合酶链反应（q RT-PCR）揭示DMSNs-NH2-pASvicR对vicR表达的影响;构建大鼠龋病模型,通过体视显微镜观察和Keyes评分探究DMSNs-NH2-pASvicR对变异链球菌体内致龋性的影响。 结果: 1.成功合成了粒径约60 nm,孔径约8 nm,平均Zeta约+6 mV,比表面积约449.1 m2g-1和孔体积约0.8 cm3g-1的分散性良好的DMSNs-NH2。 2.DMSNs-NH2能够成功负载pASvicR并具有保护pASvicR免受DNase I降解的能力;当DMSNs-NH2与pASvicR质量比为80时,92%的pASvicR能被负载;负载在DMSNs-NH2上的pASvicR能进入变异链球菌UA159并成功表达;DMSNs-NH2-pASvicR对HGFs无明显毒性。 3.SEM结果显示DMSNs-NH2-pASvicR组的生物膜缺乏网络交联的三维结构,暂未观察的菌体本身的形态结构异常;CLSM结果显示DMSNs-NH2-pASvicR组生物膜的菌量无明显变化,然而EPS量及糖菌比降低（P<0.0001）;qRT-PCR结果显示DMSNs-NH2-pASvicR组的vicR表达下降明显（P<0.0001）;大鼠下颌磨牙的体视显微镜图片显示DMSNs-NH2-pASvicR组无明显龋坏或仅有少量浅龋,Keyes总评分显著低于对照组（P<0.01）。 结论: 综上所述,DMSNs-NH2适合作为递送pASvicR进入变异链球菌的载体。DMSNs-NH2-pASvicR能够靶向抑制变异链球菌生物膜的形成、降低变异链球菌的致龋性。DMSNs-NH2-ASvicR有望在未来进行临床转化,成为一种新型防龋药物,并且可以为探索其它能够靶向抗菌并维持微生态平衡的药物提供思路。 ...
由于创伤、肿瘤、先天畸形或衰老等原因造成的骨组织缺损是临床治疗难点之一,公认治疗的金标准是自体骨移植,但由于供区骨量的限制,骨组织仍存在巨大的临床缺口。随着技术的发展和成熟,骨组织工程(Bone tissue engineering,BTE)材料成为骨组织缺损的修复有效策略,但在临床应用的过程中也仍有很多问题亟待解决,构建性能和结构优良的组织工程支架材料仍然是BTE研究的重点。 成骨细胞在骨组织修复过程中发挥了重要的作用,BTE材料的设计理念之一便是促进细胞的成骨分化能力。虽然在促进成骨分化中取得了一定的成果;但是很多研究体外和体内的结论并不一致,随着研究的深入,发现BTE材料与宿主之间的免疫反应可以对骨组织的修复效果产生影响。作为一种外来异物,BTE材料植入体内以后会引起宿主局部环境的免疫炎症反应,材料与宿主免疫系统的相互作用因为受到很多因素影响,往往是不可控的,这也影响了 BTE材料的骨组织修复效果。因此,在BTE材料设计阶段通过靶向修饰来调节免疫细胞的功能是BTE材料未来的发展方向之一。为了构建一种既可以促进成骨又可以调节宿主免疫细胞功能的多功能支架材料,我们进行了相关探索。 纳米羟基磷灰石(Nano-hydroxyapatite,n-HA)与组成人体硬组织的无机成分相似,被广泛的应用于BTE材料中。但是n-HA脆性高的特性不利于材料的稳定和成型,通常与其他聚合物以复合物的形式用于BTE当中。本研究选用生物相容性好的聚氨酯(polyurethane,PU)弹性体作为介质与n-HA进行复配,两者可以实现性能的互补。研究表明介孔二氧化硅对免疫细胞特别是巨噬细胞的极化具有一定的调节作用。为进一步探索材料对免疫细胞的调节功能,我们在PU/n-HA复配的基础上引入了介孔二氧化硅,期望通过对免疫巨噬细胞的调控改善局部免疫微环境,促进组织缺损的修复。 骨稳态的维持有赖于成骨细胞和破骨细胞正常功能的发挥。BTE材料植入后的炎症反应过程中释放的炎症因子可以诱导破骨细胞的成熟,破骨细胞功能亢进将对骨组织缺损的修复产生负面效果,在骨修复过程中可以对破骨细胞的功能进行调控从而促进骨组织缺损的修复。唑来膦酸作为一种治疗骨质疏松的双膦酸盐类药物,可以抑制破骨细胞形成,临床中更多的是用于治疗骨质疏松;但是,在骨组织缺损修复过程中通过使用低剂量唑来膦酸调控破骨细胞功能来促进骨组织修复的相关研究较少,其效果和安全性仍有待进一步探索研究。 研究目的:本研究旨在充分发挥3D打印的制备优势的基础上,从调节成骨细胞、破骨细胞、免疫细胞功能的角度对材料体系进行优化,制备一种具有多角度调控功能的BTE支架体系;在纳米羟基磷灰石与聚氨酯复配的基础上,通过掺杂介孔二氧化硅对材料性能进一步改进,探索其对巨噬细胞极化以及骨组织缺损修复的影响;同时探究使用低剂量唑来膦酸调控破骨细胞的功能对骨组织修复的影响,为BTE材料在骨组织缺损中的修复提供一种新的思路和方法。 材料和方法: 1.3D打印PU/n-HA掺杂介孔二氧化硅支架的制备与表征 制备完n-HA之后,结合介孔二氧化硅,通过3D打印的方式制备多孔支架,然后通过扫描电子显微镜察表面形貌,通过能谱分析检测各组分在支架中的分布情况,通过傅立叶变换红外吸收光谱仪和X射线衍射仪进一步对支架进行结构表征,利用万能材料试验机对支架的力学性能进行测试,并通过接触角测试进一步对支架的亲水性进行验证。 2.3D打印PU/n-HA掺杂介孔二氧化硅支架骨免疫调节作用及不同浓度唑来膦酸对破骨细胞形成的影响 通过将3D打印支架与RAW264.7细胞共培养一段时间后,利用流式细胞术检测巨噬细胞的极化状态;运用LPS对RAW264.7进行诱导后通过与支架材料共培养的方式对巨噬细胞极化进行干预,通过qRT-PCR检测巨噬极化相关基因和Western Blot对极化相关蛋白的表达,评估支架组分对巨噬细胞极化的影响;使用低剂量唑来膦酸对RANKL诱导破骨细胞的过程进行干预,通过Western Blot对破骨细胞的相关蛋白进行检测,验证抑制破骨细胞形成的最适唑来膦酸剂量。 3.3D打印PU/n-HA掺杂介孔二氧化硅支架体外细胞生物学相容性及体外成骨作用研究 3.1使用含有三种不同浓度唑来膦酸的培养基培养BMSCs和RAW264.7细胞通过CCK-8和LIVE/DEAD染色探究不同浓度的唑来膦酸对细胞生存率的影响; 3.2通过将材料与BMSCs和RAW264.7细胞进行共培养通过LIVE/DEAD和F-actin、DAPI染色检测材料对细胞生存和形态的影响; 3.3通过材料与RAW264.7细胞共培养制备成骨诱导条件培养基,探究材料对BMSCs细胞向成骨分化的影响,通过qRT-PCR、Western Blot、ALP和茜素红染色探究成骨分化相关标志物的表达情况; 3.4通过将支架材料与大鼠血管内皮细胞体外共培养,探究支架组分对血管内皮细胞成管的影响。 4.3D打印PU/n-HA掺杂介孔二氧化硅支架骨缺损修复的体内实验研究 4.1通过拔除大鼠上颌磨牙配合低剂量唑来磷酸同期使用,采用Micro-CT扫描和组织学检测探究较低剂量唑来膦酸的使用对大鼠牙槽窝愈合的影响; 4.2通过构建大鼠股骨骨组织缺损模型,在缺损中植入多孔支架,植入术后预定时间内取材,利用Micro-CT和组织学染色以及免疫组化染色探究骨组织缺损的修复情况,通过qRT-PCR和ELISA分别检测骨缺损周围组织和血清中炎症因子的表达情况,进一步运用免疫组化染色探究组织细胞的炎症反应情况。 研究结果: 1.通过3D打印制备的PU/n-HA掺杂介孔二氧化硅支架各组分在支架体系中均匀分布,支架均一性好,介孔二氧化硅的加入使支架材料的杨氏模量提高了约 36.6%; 2.3D打印PU/n-HA掺杂介孔二氧化硅支架可以调节巨噬细胞的极化,含有介孔二氧化硅的PHS组和含有介孔二氧化硅及唑来膦酸的PHSZ组可以诱导巨噬细胞M2抗炎表型分化,促进抗炎因子的释放;1×10-5mol/L浓度的唑来膦酸在不影响成骨的同时,可以抑制破骨细胞相关蛋白的表达; 3.体外细胞实验表明,3D打印PU/n-HA掺杂介孔二氧化硅支架具有良好的细胞相容性,体外成骨诱导实验证明,掺杂介孔二氧化硅可以促进成骨相关基因和蛋白的表达,1 × 10-5mol/L浓度的唑来膦酸的使用对骨髓间充质干细胞和RAW264.7细胞的生长没有明显的抑制作用;支架材料可以有效促进血管内皮细胞体外成管效果,唑来膦酸的加入对血管内皮细胞成管能力没有明显的抑制作用; 4.体内动物实验表明,低浓度唑来膦酸注射同期与大鼠上颌磨牙拔除实验表明,唑来膦酸不影响拔牙窝的修复效果;3D打印PU/n-HA掺杂介孔二氧化硅支架可以有效的促进大鼠股骨缺损的修复,介孔二氧化硅的使用可以有效调节骨缺损周围的免疫微环境,促进抗炎细胞因子的释放。 综上所述,在PU/n-HA的基础上掺杂介孔二氧化硅可以有效地改善3D打印支架的力学性能,通过对成骨细胞、免疫细胞、破骨细胞等多角度出发对材料进行优化改性,可以实现对巨噬细胞极化的调节,促进抗炎因子的释放,有效促进成骨相关标志物的表达从而实现促进成骨、成血管的效果。1×10-5mol/L的唑来膦酸可以有效抑制破骨细胞的形成,通过对免疫细胞极化的调节,促进成骨细胞分化和抑制破骨细胞功能协同促进了骨组织缺损的修复效果。为包括颌骨在内的骨组织缺损提供一种新的思路和选择,也为临床中低剂量使用唑来膦酸用于骨组织缺损修复的可行性提供一定的参考。 ...
肿瘤的经典治疗方法在消除肿瘤的同时,手术切除创面大和易残留的缺陷以及化学治疗和放射治疗存在的骨髓抑制、免疫抑制及多药耐药等问题一直是癌症治疗面临的巨大挑战,探索恶性肿瘤治疗的安全高效新策略已迫在眉睫。光热治疗是近年来兴起的一种新型癌症治疗方法,其基于肿瘤细胞与正常细胞对温度耐受程度的不同,利用光热转换材料将辐照光的能量转换为热,在肿瘤病灶产生局部高温从而杀灭肿瘤,具有高选择性、高精度、对正常组织无创/微创等显著优势。超声成像由于操作简单、无辐射、实时成像等优势在肿瘤诊断及手术导航上具有极大的发展潜力,但其成像灵敏度和分辨率却严重依赖于超声造影剂的增强。本论文针对肿瘤诊断与治疗的临床需求,选择具有优良生物安全性与光热转换性能的普鲁士蓝微粒作为光热治疗的光热剂,经表面介孔二氧化硅包覆后,负载具有良好生物安全性与相转变性能的全氟己烷,利用普鲁士蓝微粒优良的近红外光热转换能力实现肿瘤的光热治疗,同时利用超声触发全氟己烷的液-气相变产生微气泡实现超声成像增强,构建兼具肿瘤光热治疗与超声成像增强的多功能平台。本论文的主要研究内容与研究结果如下: （1）以铁氰化钾为原料、聚乙烯吡咯烷酮为还原剂,采用水热法合成普鲁士蓝微粒。在此基础上,以正硅酸乙酯为原料、十六烷基三甲基溴化铵为模板剂,采用溶胶凝胶法进行普鲁士蓝微粒表面介孔二氧化硅包覆。合成的普鲁士蓝微粒PB和介孔二氧化硅包覆普鲁士蓝微粒PB@mSiO2均呈方形核壳结构,粒径分别为148 nm和204 nm,在水、PBS和生理盐水等介质中具有较高的分散稳定性。PB@mSiO2微粒的比表面积和孔容分别为1086 m2/g和1.33 cm3/g,平均孔径为4.38 nm,有较高的负载能力;在近红外光照射下具有优良的近红外吸收和光热转换能力及光热稳定性。 （2）细胞毒性、溶血实验和体外凝血试验结果表明,PB@mSiO2微粒具有良好的细胞和血液相容性。PB@mSiO2微粒对4T1细胞的光热毒性试验中,1000ppm材料组在近红外辐照下乳腺癌4T1细胞的存活率低于15%,表明PB@mSiO2微粒在近红外辐照下能够进行光热转换并有效的杀死4T1细胞;PB@mSiO2-PFH微粒体外超声信号增强试验中,1000 ppm材料组超声图像灰度值从5提高到110,表明PB@mSiO2-PFH能在超声触发下释放全氟己烷并迅速形成微气泡,从而显著增强超声信号,提高超声图像灰度值。 （3）通过构建小鼠乳腺癌原位模型并对其进行体内肿瘤组织的光热治疗和超声成像实验。PB@mSiO2+NIR组小鼠的肿瘤组织在治疗14天后几乎完全消失,而对照组小鼠肿瘤长到了约400 mm3,表明PB@mSiO2微粒在近红外光照射下能够有效的治疗小鼠乳腺肿瘤。PB@mSiO2-PFH微粒组小鼠肿瘤部位超声图像灰度值约为47,PB@mSiO2-PFH+NIR组的超声灰度值为87,表明PB@mSiO2-PFH微粒在高温气化与超声触发的协同作用下能够更加有效地形成微气泡,显著增强肿瘤部位的回声反射率和超声后向散射信号,提高超声成像的灵敏度和分辨率。 综上所述,本研究制备的PB@mSiO2-PFH复合微粒具有较高的PFH负载能力、光热转换性能和生物相容性,在体外细胞试验与动物实验中表现出优良的超声信号增强和光热消融肿瘤能力。PB@mSiO2-PFH复合微粒具有在近红外光辐照下实现高效肿瘤热疗和增强超声成像联合应用的潜力。 ...
背景: 糖尿病牙周炎（Diabetic periodontitis,DP）发病率高、病程长、病症重,已成为口腔临床亟待解决的难题之一。目前常规的治疗主要是采用全身降糖联合牙周基础治疗的策略,但大量临床结果显示,该策略不仅在局部抗炎以及修复缺损组织等方面表现欠佳,同时对患者血糖代谢能力的调控作用有限,而且该治疗方式涉及了抗生素的应用,容易产生耐药性,不利于后续治疗。现研究者普遍认为DP的治疗应兼具长效局部抗炎、保护牙周软硬组织以及改善机体血糖代谢的特点。通过抑制促炎亚型巨噬细胞（Pro-inflammatory macrophages,M1）形成,同时促进组织修复亚型巨噬细胞（Tissue repair macrophages,M2）转变的宿主免疫调控疗法（Host-modulation therapy,HMT）被认为是治疗牙周炎的理想策略,如何筛选出合适的药物模型是HMT获得良好效果的关键。天然小分子白藜芦醇（Resveratrol,RSV）兼具抗炎、抗氧化以及提升机体胰岛素敏感性的功能,因此理论上可作为经由HMT治疗DP的候选药物。但RSV存在水溶性差、代谢迅速和血浆半衰期短等缺点,限制了它在临床上的应用,因此需要通过特殊载药手段提升其稳定性,延长其药理作用。基于上述背景,本研究首先利用化学接枝方法成功获得携载RSV的介孔硅纳米粒（RSV-grafted mesoporous silica nanoparticles,MSN-RSV）,随后通过一系列检测手段系统评价其理化性能、药物稳定性以及细胞毒性等。接下来建立DP大鼠模型,并评估MSN-RSV在牙周袋局部应用后对DP的作用效果。此外,本课题深入分析了MSN-RSV对巨噬细胞极化行为的调控作用,并初步探索了相关的分子机制。最后,考虑到糖尿病与牙周炎之间具有明确的双向关系,本实验在确证了MSN-RSV能够减轻DP炎症的前提下,进一步研究了材料联合胰岛素对II型糖尿病（Type II diabetes mellitus,T2DM）关键指标——胰岛素抵抗（Insulin resistance,IR）和糖代谢的影响。 方法: 本研究采用三步法合成MSN-RSV,分以下四个实验进行深入研究: 1.实验一首先通过扫描电镜（Scanning electron microscopy,SEM）、透射电镜（Transmission electron microscopy,TEM）、傅里叶红外光谱（Fourier-transform infrared spectroscopy,FTIR）、Zeta电位测量、紫外可见吸收光谱（Ultraviolet and visible absorption spectrum,UV-Vis）、X射线光电子能谱技术（X-ray photoelectron spectroscopy,XPS）和核磁共振碳谱(Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrometry,13C-NMR)表征材料外观形貌和接枝过程。然后通过采集上清游离药物分析MSN-RSV在水溶液的接枝稳定性并考察了MSN-RSV在模拟唾液中的释放行为。通过1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）清除实验表征材料的抗氧化性。采用细胞计数试剂（Cell counting kit-8,CCK-8）和采集细胞摄取纳米粒的TEM图像表征材料的细胞毒性。最后通过流式细胞技术和荧光图像评估细胞的摄取MSN-RSV的效率。 2.实验二首先通过联合应用高糖高脂饲料喂养、小剂量链脲霉素注射（Streptozotocin,STZ）以及丝线结扎上颌第二磨牙的方法构建大鼠DP模型。模型构建成功后以局部注射形式给药,收集颌骨标本通过Micro-CT扫描、抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resistant acid phosphatase,Trap）染色、苏木素&伊红（Hematoxylin and eosin,H&E）染色和Masson染色,评估MSN-RSV抗炎作用对缓解骨吸收和牙周纤维破坏的影响,并对巨噬细胞M1型、M2型特异标记物进行免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）染色分析和免疫荧光（Immunofluorescence,IF）染色分析,评估MSN-RSV对巨噬细胞极化行为的影响。 3.实验三用牙龈卟啉单胞菌来源脂多糖（Porphyromonas gingivalis-derived lipopolysaccharide,P.g.-LPS）作为炎症刺激同时结合高糖培养条件模拟DP微环境。通过实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-q PCR）和酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测RAW264.7巨噬细胞极化亚型相关m RNA表达和细胞因子分泌情况。然后通过流式细胞术检测不同亚型阳性细胞比例并通过IF和免疫印迹试验（Western blot,WB）检测特异性蛋白表达,分析MSN-RSV对巨噬细胞极化的影响。最后通过检测与极化相关的信号通路,研究MSN-RSV调控免疫反应的分子机制。 4.实验四应用DP大鼠定期规律皮下注射胰岛素进行全身血糖控制,同时牙周注射MSN-RSV进行局部牙周治疗。通过表征血浆胰岛素（Plasma insulin level,PIL）和胰岛素抵抗指数（Homeostasis model assessment of insulin resistance index,HOMA-IR）评估MSN-RSV辅助治疗对IR的影响,借助ELISA、IHC和IF手段分析炎症因子及IR相关信号分子在牙周组织和血浆中的表达差异,以及通过腹腔注射葡萄糖耐受实验（Glucose concentration obtained from intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT）和检测糖化血红蛋白（Glycated hemoglobin,GHb）含量,明确该治疗方式对糖代谢能力的作用。 结果: 1.本课题经过三步法将RSV稳定接枝在介孔硅纳米粒子上,接枝量为（33.73±0.61）%。该体系具有低细胞毒性,与RSV相比,MSN-RSV能够持续发挥清除DPPH自由基的作用,并能提高细胞对药物的摄取效率。 2.MSN-RSV可通过减少巨噬细胞向M1极化同时促进M2生成实现持续抗炎效果,对比其他处理组,最大程度减少了DP大鼠的牙周组织破坏。 3.MSN-RSV能够持续地减少M1相关促炎因子如肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、IL-6和诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,i NOS）的表达,并增加M2相关抗炎细胞因子精氨酸-1（Arginase-1,Arg-1）和IL-10的表达,参与炎症抑制和免疫调控。MSN-RSV还能以剂量依赖形式抑制核因子激活的B细胞的κ-轻链增强子p65亚基磷酸化(Phosphorylated-nuclear factor-kappa B（NF-κB）p65,p-p65)、NF-κB抑制蛋白磷酸化（Phosphorylated-NF-κB inhibitor,p-IκB）和信号转导及转录激活因子-3磷酸化（Phosphorylated-signal transducer and activator of transcription-3,p-STAT3）,并且增加沉默信息调节因子1（Silent information transcription regulator 1,SIRT1）和磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（Phosphorylated-AMP-activated protein kinase,p-AMPK）的表达。 4.MSN-RSV与胰岛素联合能显著改善糖尿病大鼠的PIL和HOMA-IR,减少TNF-α在牙周组织中的表达和血浆中的含量,并能显著提高牙周组织中SIRT1和AMPK的表达水平,但对IPGTT、GHb的影响没有统计学意义。 结论: 介孔硅作为载体提高了RSV的稳定性和细胞摄取效率,延长了药效时间,并可持续有效抑制巨噬细胞向M1极化的同时加速M2的极化。其原因可能与AMPK/SIRT1信号通路被激活和NF-κB/STAT3信号通路被抑制有关。MSN-RSV与胰岛素联合应用后,DP大鼠的IR得到明显改善,但糖代谢能力与对照组相比没有显著变化。 综上所述,本研究证实将RSV化学接枝在MSN上可有效提升药物稳定性,所得产物MSN-RSV能够通过免疫调控的方式持续有效地减轻糖尿病影响下的 牙周炎炎症状况,为DP治疗提供了一种切实可行的策略,也为RSV相关药物载体的开发提供支持。同时,研究还关注了材料与胰岛素联合使用后对机体糖尿病关键指标——IR以及糖代谢能力的影响,为后续深入揭示牙周炎与糖尿病之间的相互作用机制提供一定的理论依据。 ...
骨组织工程中生长因子的引入,可增加人工骨的生物活性。但临床使用的外源性生长因子在体内易被降解,且不恰当的剂量会造成异位成骨、血管畸形等问题。现阶段已有许多活性元素被证明可以发挥类似生长因子的功能,参与对骨组织修复过程的调控。同时由于活性离子在体内较为稳定,可以持续发挥其相关作用,成为骨修复领域的研究热点。 钒被证明是一种胰岛素类似物,在糖尿病治疗领域中获得广泛关注,同时五价钒的化学性质与磷极为相似,可以替代羟基磷灰石中的磷酸基团并稳定存在于骨组织中,具有较大的骨修复潜能。但现阶段对于钒在骨修复领域的研究仍极为匮乏。因此,研究钒对骨祖细胞行为的影响及其促成骨的效应及机制,对于骨修复材料的研究与临床应用具有非常重要的意义。 本研究以大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)为模型,系统探究钒对rBMSCs成骨分化的影响。通过水热法制备了钒掺杂介孔生物活性玻璃(V-MBG),考察钒掺入对MBG形貌、介孔结构以及组成成分的影响。随后在考察V-MBG离子溶出行为的基础上,以不同稀释倍数的V-MBG浸提液探究了 V-MBG的促成骨效应;最后对钒促进rBMSCs成骨分化的分子机制进行了初步探讨。本论文主要研究内容与结果如下: (1)五价钒单一离子对rBMSCs成骨分化的影响。以钒酸钠(Na3VO4)为钒源,配制含钒培养基。考察了不同浓度VO43-对rBMSCs细胞增殖、碱性磷酸酶(ALP)以及其它成骨相关蛋白表达的影响。结果表明,VO43-在1 d时无明显的细胞毒性,并在3d时表现出显著的促rBMSCs增殖效应。VO43-可促进ALP、COL-1及VEGF等成骨相关蛋白的分泌,表明VO43-良好的促成骨效应和促血管形成的潜力;但在实验周期内对OCN蛋白的分泌影响不明显。 (2)掺钒介孔生物活性玻璃的制备与表征。采用水热法合成了不同钒掺杂量的V-MBG,考察了钒在MBG中的存在形态及钒对MBG形貌、介孔结构以及组成成分的影响。结果表明,钒主要以五价钒的形式进入MBG的硅氧网络,部分钒生成CaV物种嵌入硅氧网络。钒掺入提高了 V-MBG中钙的含量,降低了硅含量。同时,钒掺入显著减小了 V-MBG的比表面积与介孔孔体积,这可能是钒掺入影响材料合成过程中P123胶束化以及降低了合成过程中的驱动力所致。 (3)不同稀释倍数V-MBG浸提液对rBMSCs成骨分化影响。结果表明,稀释倍数高于16倍时,稀释后V-MBG浸提液在3 d时明显促进了 rBMSCs的增殖。稀释后的1V-MBG浸提液在3 d时较相同稀释倍数下的MBG浸提液促进了 COL-1蛋白的分泌,并在7 d时显著促进了 ALP和OCN蛋白的分泌,表明稀释后的V-MBG浸提液具有良好的促rBMSCs成骨分化能力。 (4)钒离子及V-MBG浸提液对WNT/β-catenin信号通路相关基因表达的影响。采用含五价钒的培养基、稀释64倍的MBG浸提液和1V-MBG浸提液,初步验证了五价钒离子促进rBMSCs成骨分化的分子机制。结果表明,含五价钒培养基、稀释64倍的MBG浸提液和1V-MBG浸提液较对照组均明显促进了WNT/β-catenin信号通路相关基因(WNT 3a、β-catenin及AXIN)的表达,且1V-MBG浸提液较含五价钒培养基以及MBG浸提液表现出更明显的上调WNT/β-catenin信号通路相关基因表达。表明钒与MBG中的钙、硅和磷离子共同作用促进WNT/β-catenin成骨信号通路的表达。 综上所述,钒在MBG中主要以五价钒的形式进入硅氧网络,部分钒生成CaV物种嵌入硅氧网络,在生理环境中,掺入的钒可持续释放,与钙、硅和磷离子协同,通过WNT/β-catenin成骨信号通路促进rBMSCs增殖与成骨分化。...
抗生素残留的检测对保障生态环境安全和公众健康至关重要。在众多分析方法之中,荧光分析法因具备高灵敏度、操作简单和响应速度快等优点而被广泛应用。然而,大部分抗生素荧光传感体系存在光稳定性不足、水分散性差等问题,严重制约了其对目标物的检测灵敏度。因此,制备高灵敏度、高稳定性的抗生素荧光检测体系具有重要的现实意义。介孔二氧化硅SBA-15凭借其较大的比表面积和优异的化学稳定性,成为极具前景的光学传感基质材料。本研究分别以碳量子点（CDs）、镧系金属离子(Eu3+)、有机荧光分子(N-（1-萘基）乙二胺（NED）、1-（溴乙酰）芘（Py）和异硫氰酸荧光素酯（FITC）)以及类水滑石（HTlc）作为荧光信号单元,利用SBA-15作为固体保护基质,成功构建了三种具有高灵敏度和优异光稳定性的荧光传感体系,实现了对抗生素的单信号、双信号和三重信号痕量检测。具体研究内容如下: （1）为了实现抗生素检测体系的光稳定性和重复利用性,将CDs与SBA-15复合构建了纳米探针CDs@SBA-15,并将其应用于盐酸金霉素（CTC）的“turn-off”模式荧光检测和庆大霉素（GTM）的“turn-on”模式荧光检测。SBA-15作为保护基质有效改善了CDs的聚集诱导淬灭效应（ACQ）,其纳米限域效应显著提升了复合探针对GTM检测性能。荧光增强系数（Kec）为2.01×10～5,检出限（LOD）为29 n M。基于静电作用与光诱导电子转移（d-PET）机制协同作用,该复合探针实现了对CTC高灵敏检测,LOD低至113 n M,荧光淬灭常数（Ksv）为5.16×10～4。 （2）为提升检测灵敏度,优化检测模式,构建了含多反应位点的荧光纳米探针。基于双反应位点传感体系的设计要求,在SBA-15基质中引入了羧酸基团修饰的大环配体(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）)。通过接枝NED与镧系金属(Eu3+),制备了比率荧光探针NED-DASBA@Eu。利用NED的蓝色荧光（434 nm）与Eu3+的红色荧光信号（617 nm）之间的反向变化关系,在0–100μM浓度范围内实现了对盐酸土霉素（OTC）和盐酸四环素（TC）的比率检测,其对OTC和TC的LOD分别为0.029和0.066 n M。鉴于NED-DASBA@Eu在TCs检测中展现的优异光学性质及较高的灵敏度,构建了智能手机辅助的便携式纸基传感平台。此外,基于重氮化-偶联反应机制,在NO2–的介导下,构建了磺胺类抗生素（SAs）的定性与定量比色分析体系,其对磺胺甲噁唑（SMX）、磺胺甲噻二唑（SMT）、磺胺甲基嘧啶（SMR）和磺胺异噁唑（SIZ）的LOD分别为0.76、0.89、0.92和1.43 n M。此外,智能手机辅助的TCs便携式传感平台以及SAs的比色分析方法已成功应用于自来水、蜂蜜和湖水样品,进一步验证了所设计的传感系统在现场检测中的便利性。本项工作基于双反应位点的协同作用,建立了新型抗生素区分检测方法,为复杂基质中抗生素残留的鉴别提供了有效解决方案。 （3）为实现抗生素的痕量检测,扩大荧光颜色变化的范围,制备了三发射比率荧光探针。首先,利用Py对SBA-15进行改性修饰,得到具有蓝色荧光（384 nm）的PASBA。以PASBA为模板,具有红色荧光（617 nm）的Eu3+掺杂HTlc在PASBA孔道内外生长,并引入绿色荧光分子FITC（520 nm）构建了比率荧光探针HTlc:Eu@PASBA-F,用于TCs的灵敏检测。由于内滤效应（IFE）、d-PET机制和天线效应（AE）,该探针在TCs存在下表现出显著的三重荧光发射特性,其对OTC和TC的LOD分别为0.016和0.035 n M。此外,随着TCs的加入,传感体系的颜色由青色逐渐变为绿色、黄色、橙色,最后变为红色。利用该体系的多色变化特性,开发的便携式传感平台可满足现场监测需求。 ...
细菌耐药性问题现在影响深远,从而大大降低了当前抗生素的有效性,仅2019年因细菌抗药性引起死亡人数占全球总人数1/8,已成为全球第二大死因,造成了日益严重的全球挑战,对抗生素具有更明显耐药性的病原菌感染正在威胁全球公共卫生,并给全球医疗系统带来额外负担。与有机抗菌材料相比较,稀有金属离子由于具有广谱抗菌性、耐热性好、分散性好及抗药性小等优异性能而应用于各种生物材料和医疗器械中。Ce元素与Cu元素是常见的抗菌类金属材料,CeO2具有类酶特性,会产生ROS破坏细菌细胞壁,使细菌裂解死亡。Cu离子具有类芬顿特性,进入到细菌的细胞内,使得细菌的细胞壁发生破壁,细胞液外流,造成细菌的死亡。此外Cu离子还具有伤口修复的功能。我们水热还原法,一步制备出铈铜共掺杂的纳米抗菌材料材料,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌进行了指示性测试,分析表征探究机理,并进行生物伤口修复评估。与传统抗生素和抗微生物药物相比,Ce-Cu共掺杂材料的引入在抗菌方面具有突出优势,电子显微镜下观察到细菌边界破坏明显,细胞质流失严重。当材料浓度达到100μg/ml时,细菌与材料混合后吸光度从0.9降低到0.6,杀菌率达到90%,且在生物体中,伤口愈合较快,伤口愈合速度较未涂抹材料细菌感染程度降低87%,伤口面积减少4/5,菌类感染较少。我们合成的Cu-Ce共掺杂介孔纳米硅材料抗菌效果明显,将稀土元素与常见元素结合起来,稳定、高效性、广谱性好,为抗菌材料的发展提供了新的思路。 ...
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