编号：YYHY00944

篇名：烟酰胺单核苷酸微球及其抗化疗/放疗诱导的骨髓抑制研究

作者： 余彬

关键词： 烟酰胺单核苷酸; PLGA微球; 化疗/放疗; 骨髓抑制; 造血功能损伤防护; PI3K/AKT/Bcl-2信号通路;

机构： 烟台大学

摘要： 骨髓抑制是肿瘤放化疗过程中伴随发生的常见不良反应,会导致骨髓造血功能降低,白细胞、红细胞和血小板数量减少,免疫力下降、贫血和易出血等严重的健康问题,影响临床效果和生存质量,在肿瘤治疗领域受到广泛关注。烟酰胺单核苷酸（Nicotinamide Mononucleotide,NMN）是一种内源性核苷酸,具有广泛的生理活性,尤其对血液衰竭的重建和恢复显示有治疗潜力,其对于化疗/放疗所致骨髓抑制而产生的造血功能损伤的防护效应及分子机制尚不明确。与此同时,NMN的应用面临系统生物利用度低、给药频繁、使用周期长且易受食物影响的挑战。 有鉴于此,本论文首先基于真实世界数据对药物所致的不良反应/事件进行全面探讨,重点分析化疗药物在治疗过程中发生机率最大、且较为严重的不良反应/事件,在此基础上构建动物模型,探究NMN对化疗/放疗所致发生率较高的不良反应/事件的防护效应及分子机制;设计具有高生物利用度和缓释作用的微球递送系统NMN微球（NMN-microspheres,NMN-MS）,优化制备工艺,评价其对化疗/放疗所致该不良反应/事件的防护效应。研究结果有助于推动NMN在骨髓造血功能损伤治疗中的临床应用,促进NMN制剂的研发与革新,同时为肿瘤放疗后骨髓抑制防护制剂的开发提供新思路。论文研究围绕以下五个方面开展。 1.药品不良反应/事件分析 基于某医院近7年的药品不良反应/事件数据,重点分析化疗药物在抗肿瘤治疗中的不良反应发生情况。通过对209例不良反应/事件报告的分析,发现非小细胞肺癌、结肠癌及直肠癌患者的不良反应发生率较高,其中铂类药物引发的不良反应占比最高（32%）,且以发热性中性粒细胞减少、白细胞计数减少、中性粒细胞计数减少及血小板计数减少等骨髓抑制表现为主;奥沙利铂、顺铂、紫杉醇及卡培他滨等化疗药物是引发严重不良反应的主要品类,尤其是骨髓抑制现象最为常见。研究结果表明骨髓抑制是奥沙利铂、顺铂等药物化疗过程中最常见且发生率最高的不良反应,为后续NMN在化疗所致骨髓抑制的防护效应研究设计提供了科学依据。 2.NMN对化疗/放疗致骨髓抑制的防护效应与分子机制 研究构建顺铂和射线辐照诱导小鼠骨髓抑制模型,在此基础上探讨NMN对造血功能损伤的防护作用及其分子机制。结果表明,顺铂和射线辐照均能成功诱导小鼠产生骨髓抑制,与Model组相比,NMN处理能够有效改善模型小鼠的外周血细胞计数、骨髓有核细胞（Bone marrow nucleated cells,BMNC）和造血干细胞（Hematopoietic stem cell,HSC）降低,促进造血因子分泌,降低股骨损伤,对于骨髓抑制所致造血功能损伤发挥显著的防护作用。生物信息学分析和分子生物学实验验证研究表明,NMN可显著上调p-PI3K、p-AKT蛋白及m RNA的表达,并增加Bcl-2蛋白水平,通过激活PI3K/AKT/Bcl-2通路,抑制HSC的降低,从而实现对骨髓抑制所致造血功能损伤的有效防护。 3.NMN-MS制备、表征及药动学研究 以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly（lactic-co-glycolic acid）,PLGA)为载体,采用水包油包固（Solid-in-oil-in-water,S/O/W）乳化溶剂挥发法制备NMN-MS,通过单因素和正交试验进行处方和工艺优化,获得最优微球制备条件为PLGA 5050 2E、PLGA浓度100 mg/mL、油水比1:10。表征结果显示,所制备的微球表面光滑,形态完整,粒径～120μm,分布均匀,载药量～6%,包封率>50%。体外释放实验表明,微球在12 d内的药物释放率>90%,释放机制以扩散为主。以NMN原料药静脉注射为对照的大鼠药动学研究发现,NMN-MS皮下注射的生物利用度为114.74±3.37%,显著高于NMN的口服生物利用度（75.56±9.18%,p<0.01）;平均滞留时间(Mean residence time,MRT0-∞)、半衰期(Half-life,t1/2)分别为297.56±126.60 h和240.18±116.02 h,也显著高于口服NMN（p<0.05）,结果表明NMN-MS皮下注射是适于NMN体内给药的理想药物递送形式。 4.NMN-MS对顺铂致小鼠骨髓抑制的防护效应研究 基于小鼠模型研究NMN-MS对顺铂诱导的骨髓抑制后造血功能损伤的保护作用。结果表明,NMN-MS能显著抑制顺铂导致的外周血细胞(白细胞:3.69±0.59×10～9/L,红细胞:10.26±0.79×1012/L,血红蛋白:141.4±9.09 g/L,血小板:1223.90±149.91×1012/L)和BMNC（5.49±0.38×10～6）的降低,促进多个造血因子分泌;在不显著影响BMNC周期的同时有效抑制BMNC凋亡,凋亡率为8.96%,并提高HSC水平（CD34+2.34%）。病理染色结果显示NMN-MS可减轻股骨损伤,降低氧化应激因子,无炎症反应,且胸腺和脾指数,脾免疫球蛋白G（Immunoglobulin G,Ig G）,CD4+T细胞,CD8+T细胞,CD4+/CD8+T细胞在淋巴细胞中百分率也显著提升,从而增强免疫。这些结果表明NMN-MS对化疗致骨髓抑制后的造血功能损伤、炎症反应、氧化应激及免疫功能具有显著的防护效果。 5.NMN-MS对射线辐照致小鼠骨髓抑制的防护效应研究 基于小鼠模型研究NMN-MS对射线辐照诱导的骨髓抑制后造血功能损伤的保护作用。结果表明,NMN-MS能显著抑制X射线辐照导致的外周血细胞(红细胞:（9.64±0.36）×1012/L,血红蛋白:131.60±6.02 g/L,血小板:（583.20±28.54）×1012/L)和BMNC（1.94±0.21×10～6）的降低,促进多个造血因子分泌;在不显著影响BMNC周期的同时有效抑制BMNC凋亡,凋亡率为7.51%,并提高HSC水平（CD34+2.41%）。此外,病理染色结果显示NMN-MS可减轻股骨损伤,降低炎症及氧化应激因子,且胸腺和脾指数,脾Ig G,CD4+T细胞,CD8+T细胞,CD4+/CD8+T细胞在淋巴细胞中百分率也显著提升,从而增强免疫。这些结果表明NMN-MS对放疗致骨髓抑制后的造血功能损伤、炎症反应、氧化应激及免疫功能具有显著的防护效果。 综上所述,本论文基于药品不良反应/事件的真实世界数据分析揭示了肿瘤治疗中骨髓抑制的高发性及其临床挑战,探索了NMN对化疗/放疗致骨髓抑制的防护作用和分子机制,研制了具有高生物利用度和良好释药性能的缓释微球载药系统NMN-MS,并系统评价了其对化疗/放疗致骨髓抑制的防护潜力,为推进NMN的开发应用提供了科学依据和创新思路。