编号：YYHY00948

篇名：负载hDPSCs的GelMA微球通过FAK/Rac1信号通路增强旁分泌治疗牙周炎的研究

作者： 王卓然

关键词： 人牙髓干细胞; 微球; 旁分泌作用; FAK/Rac1信号通路; 内质网出口; 牙周炎;

机构： 吉林大学

摘要： 牙周炎是一种多阶段的慢性炎症性疾病,其主要临床特征包括牙龈出血、深牙周袋形成和牙槽骨破坏,严重时造成牙齿脱落、牙列缺损及缺失等。牙周炎不仅影响咀嚼、发音等口腔功能,也是多种全身系统性疾病的诱因,包括细菌性心内膜炎、糖尿病等。临床上,牙周炎治疗的最理想效果是完全恢复牙周软组织和硬组织,但是目前临床上常用的治疗方法(牙周基础治疗和牙周手术)无法达到完全恢复牙周组织的目的。由于牙周炎患者的牙周软硬组织受到炎症环境的持续影响,导致参与牙周组织修复的细胞的生物学功能和分化能力受到不同程度的抑制,从而直接延缓牙周组织的恢复。为了实现牙周组织的再生,首先需保证炎症得到有效控制,这有利于创造良好的再生微环境,从而提高牙周组织中间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的再生能力。因此,牙周炎治疗及组织再生的关键研究方向应侧重于兼顾缓解炎症状态和增强MSCs分化潜能。 干细胞旁分泌作用指的是干细胞通过分泌细胞因子、生长因子、外泌体和囊泡等,影响周围细胞的行为、功能和命运。近年来,越来越多的研究结果表明,人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)可通过旁分泌效应释放出各种细胞因子和生长因子,表现出优异的免疫调节能力和促进MSCs成骨分化的能力,这也正是牙周再生过程中所必需的。当前研究使用的MSCs大多获取自体外二维培养中接种和生长在平面培养皿底壁的细胞,这种培养方法存在细胞衰老快、增殖分化能力随细胞代数增加而逐渐变弱、旁分泌作用不足等缺点。通过水凝胶微球三维培养的MSCs的旁分泌能力显著优于二维培养的细胞。因此,将hDPSCs负载于三维水凝胶微球表面可能对牙周炎治疗具有重要的治疗潜力和临床转化意义。综上,本研究旨在明确负载hDPSCs的三维微球体系对牙周炎的治疗作用,并探究三维培养体系对增强hDPSCs旁分泌作用的机制。 具体研究分为五部分展开: 在第一部分研究中,从人牙髓中提取和体外培养hDPSCs,并进行MSCs的类型鉴定。同时,合成PDA@GelMA微球,与hDPSCs进行共培养,构建hDPSCs/PDA@GelMA微球,明确hDPSCs/PDA@GelMA微球与hDPSCs的旁分泌作用的差异。 在第二部分研究中,以二维培养的hDPSCs为对照组,对hDPSCs/PDA@GelMA微球表面hDPSCs进行mRNA转录组测序的分析,评估hDPSCs/PDA@GelMA微球调控hDPSCs旁分泌作用的具体机制及相关通路富集情况。接着,利用western blot、细胞免疫荧光染色和ELISA法检测相关信号通路蛋白和旁分泌作用之间的关系,明确hDPSCs/PDA@GelMA微球增强其表面hDPSCs旁分泌作用的机制。 在第三部分研究中,通过牙龈卟啉单胞菌脂多糖模拟炎症环境,诱导建立Raw 264.7体外炎症模型,评估hDPSCs/PDA@GelMA微球的抗炎效果。通过实时荧光定量PCR法评估hDPSCs/PDA@GelMA微球对炎症状态下Raw 264.7促炎相关因子和抑炎相关因子基因表达的影响;通过western blot检测hDPSCs/PDA@GelMA微球对炎症状态下Raw 264.7促炎相关因子和抑炎相关因子蛋白表达的影响;通过流式细胞术检测hDPSCs/PDA@GelMA微球对炎症状态下Raw 264.7极化状态的影响;通过细胞免疫荧光法检测hDPSCs/PDA@GelMA微球对炎症状态下Raw 264.7极化相关因子表达的影响。 在第四部分研究中,通过牙龈卟啉单胞菌脂多糖模拟炎症环境,建立小鼠BMSCs体外成骨模型,评估hDPSCs/PDA@GelMA微球的促成骨潜能。通过实时荧光定量PCR法评估hDPSCs/PDA@GelMA微球对炎症状态下小鼠BMSCs成骨相关因子基因表达的影响;通过碱性磷酸酶和茜素红染色评估hDPSCs/PDA@GelMA微球对炎症状态下小鼠BMSCs的成骨分化能力的影响;通过western blot和细胞免疫荧光检测hDPSCs/PDA@GelMA微球对炎症状态下小鼠BMSCs成骨相关蛋白表达的影响。通过体外实验的结果,可以为后续在体内牙周炎模型中应用hDPSCs/PDA@GelMA微球提供重要的理论依据和实验证据。 在第五部分研究中,选用C57BL/6J小鼠建立小鼠牙周炎模型,评估hDPSCs/PDA@GelMA微球的体内抗炎和促成骨效果。通过对小鼠重要脏器的组织病理学评价,评估hDPSCs/PDA@GelMA微球在体内的生物安全性;通过Micro-CT测量小鼠上颌骨第一磨牙和第二磨牙之间的釉牙骨质界至牙槽嵴顶端之间的距离,以及骨小梁相关参数;通过组织学染色观察小鼠牙周组织的炎症状态和骨吸收情况;通过实时荧光定量PCR法检测小鼠牙周组织中相关炎症因子和成骨相关蛋白的基因表达情况。 上述研究证明了hDPSCs/PDA@GelMA微球可通过激活其表面hDPSCs胞内的FAK/Rac1通路,促进内质网出口蛋白的表达增加,从而增强hDPSCs的旁分泌作用。体外实验结果表明,hDPSCs/PDA@GelMA微球可以抑制炎症状态下Raw 264.7向M1型极化,并促进其向M2型转化。hDPSCs/PDA@GelMA微球显著抑制炎症状态下Raw 264.7的促炎相关因子(IL-1β和i NOS)的基因和蛋白表达,同时显著促进炎症状态下Raw 264.7的抑炎相关因子(IL-10和Arg-1)的基因和蛋白表达。hDPSCs/PDA@GelMA微球还可以促进炎症状态下小鼠BMSCs的成骨相关基因(Runx2,ALP,Col-1和OCN)的表达,并验证了成骨相关蛋白(Col-1和OCN)的表达增加。同时,hDPSCs/PDA@GelMA微球促进炎症状态下小鼠BMSCs中碱性磷酸酶的活性增强和钙结节的形成增多。体内实验结果表明,hDPSCs/PDA@GelMA微球可以缓解小鼠牙周组织中的炎症反应和抑制牙槽骨的吸收。