编号：YYHY00949

篇名：载氯化镧羟基磷灰石缓释微球促修复性牙本质形成的实验研究

作者： 谢晓昱

关键词： 牙髓干细胞; 中空羟基磷灰石; 氯化镧; 成牙本质细胞分化;

机构： 吉林大学

摘要： 研究背景: 年轻恒牙因处于发育阶段而呈现特殊的解剖学特征,如根尖孔未完全成形、釉质矿化程度不足、易发生脱矿,髓腔较大且髓角解剖位置较高等。这些特殊的结构使得年轻恒牙的牙体组织抵抗龋能力较弱,因此一旦发生龋坏往往进展迅速,很容易在短时间内感染牙髓甚至波及到根尖周组织,从而造成牙髓的不可逆性损伤。此类感染若未及时治疗,则会导致牙根停止发育,进而影响牙齿的生理功能与长期预后。 年轻恒牙的牙髓组织结构疏松、血管较多,富含许多尚未分化的间充质干细胞群。这种组织学特征赋予年轻恒牙牙髓显著的再生修复能力,为临床实施活髓保存术（Vital pulp therapy,VPT）提供了基础。目前临床上VPT已成为处理此类牙髓损伤的首选治疗策略。在受损牙髓表面应用活髓保存制剂可激活人牙髓干细胞（Human dental pulp stem cells,hDPSCs）的成牙本质分化潜能,刺激修复性牙本质形成。该过程既能保持牙髓活力与功能稳定,又可支持牙根系统的发育及根尖孔的闭合。这种干预策略通过双重生物学效应,显著改善患牙的远期保存成功率。 作为天然骨组织的主要无机物成分,羟基磷灰石（Hydroxyapatite,HAP）凭借其优异的生物相容性、生物活性以及骨结合特性,已经成为骨缺损修复领域的热门材料,被广泛应用于骨缺损的修复治疗。中空羟基磷灰石（Hollow hydroxyapatite microspheres,HHAM）的外部为多孔壳层结构,其内部则是独特的中空内核,这种特殊的结构提升了HAP的载药效率。目前,HHAM能够以局部缓释的方式释放药物,已被广泛应用于缓释控释领域。另外纳米羟基磷灰石（Nano hydroxyapatite,n HA）已被证实可以诱导hDPSCs向成牙本质细胞分化,并刺激修复性牙本质的形成。 稀土元素包含15种镧系元素(从镧（La）至镥（Lu）)以及钇（Y）和钪（Sc）,共计17种成员。这类元素以其高电价态、显著的化学活性以及独特的光电磁特性而著称。近年来有许多学者聚焦于稀土元素在医学领域应用的可能性。牙髓病是常见的口腔疾病,严重影响患者的生活质量。传统的治疗方法虽有一定效果,但仍存在诸多局限性。稀土元素因其优异的促成骨、抗氧化应激、抗炎及抗菌等生物活性,为牙髓病的治疗提供了新的可能性。 研究目的: 构建载氯化镧中空羟基磷灰石微球（Lanthanum chloride-loaded hollow hydroxyapatite microspheres,La-HHAM）,评估其体外缓释效果,并通过体外实验检测LaCl3的生物相容性及其诱导hDPSCs向成牙本质细胞分化的潜能。 研究方法: 1.根据仿生矿化原理合成HHAM,并通过SEM和XRD检测其物化性能表征。 2.构建载LaCl3中空羟基磷灰石微球缓释系统,并测量其载药率、包封率及体外缓释效果。 3.采用酶消化法结合组织块贴壁法分离培养hDPSCs。 4.采用流式细胞术对hDPSCs的干细胞表面抗原标记物进行鉴定,通过成骨和成脂诱导实验,评估hDPSCs的多向分化潜能。 5.采用CCK-8细胞活性检测技术评估LaCl3对hDPSCs增殖活性的作用,采用活/死细胞染色技术评估其对hDPSCs存活状态的影响。 6.通过ALP染色、ALP活性检测及茜素红染色研究LaCl3诱导hDPSCs向成牙本质细胞分化的能力。 7.通过qPCR检测在不同浓度LaCl3对hDPSCs成骨分化相关因子（RUNX2、SP7、DSPP和DMP-1）表达的影响。 实验结果: 1.SEM可见HHAM由短针状纳米颗粒组成,该特征性纳米结构单元的直径约为2-4μm,材料内部可见典型的中空微球结构。制备的最终样品的衍射峰在25.882°,28.920°,32.194°,32.896°,34.062°,35.454°,39.790°,46.693°和49.489°处与碳羟基磷灰石（PDF#74-0565）的衍射峰一致。 2.成功合成La-HHAM,载药率为19.6%,包封率为78.1%,释放曲线平缓,药物释放较为缓慢,30天累积释放率达63.84%。 3.流式细胞术分析结果显示所培养细胞群体呈现典型间充质干细胞免疫表型特征:对间充质干细胞标志物CD73（99.73%）、CD90（97.05%）及CD105（97.90%）呈阳性表达;而对造血系特异性标志物CD34（2.02%）和CD45（1.29%）则保持低表达水平。通过茜素红染色实验,可在显微镜下观察到明显的矿化结节形成,通过油红O染色可在显微镜下观察到细胞内存在颗粒状脂滴。 4.CCK8及活/死细胞染色结果显示:低浓度LaCl3(10-10、10-9、10-8mol/L)对hDPSCs的增殖无明显影响,而高浓度LaCl3(10-7、10-6、10-5、10-4mol/L)则能抑制hDPSCs的增殖。 5.ALP染色及ALP活性检测结果显示:低浓度LaCl3(10-10、10-9mol/L)可以促进hDPSCs中ALP的活性。茜素红染色结果显示:低浓度LaCl3(10-10、10-9mol/L)具有促进hDPSCs矿化的作用。 6.qPCR结果显示:低浓度(10-10、10-9mol/L)的LaCl3可显著提高RUNX2、SP7、DSPP、DMP-1等矿化相关基因的表达水平;而高浓度LaCl3(10-7mol/L)会抑制RUNX2、SP7、DSPP、DMP-1等矿化相关基因的表达。 研究结论: 1.成功合成双高药物负载特性的La-HHAM,体外缓释效果优良。 2.LaCl3具有良好的生物相容性。 3.LaCl3能有效促进hDPSCs向成牙本质分化。