编号：YYHY00955

篇名：核-壳海藻酸微球用于构建血管化肠粘膜体外模型研究

作者： 郝昕

关键词： w/w液滴模板; 核-壳结构3D凝胶微球; 血管生成; 上皮-血管化基质相互作用; 肠粘膜体外多细胞组织模型;

机构： 西南交通大学

摘要： 在肠道组织工程的研究中,选择合适的生物材料替代细胞外基质(extracellular matrices,ECMs),构建由肠上皮和具有明确血管结构的血管化基质组织结合形成的三维微结构是实现功能性构造的主要挑战。然而,现存技术由于在培养血管化组织,制备隔室化3D细胞培养载体和分区包封异质细胞方面受到限制,无法实现由多种细胞类型组成的,具有血管系统和精确控制的三维结构的肠粘膜组织模型的构建。针对上述问题,本研究以构建生理相关性肠粘膜体外模型为研究对象,引入具有明确血管结构的血管化基质组织,建立具有完整肠粘膜组织成分的血管化肠粘膜体外模型。具体地,本论文利用由同轴共挤出装置形成的水包水(w/w)液滴为模板制备了尺寸可调控的核-壳结构海藻酸凝胶微球,以该凝胶微球作为区室化3D细胞培养载体,在核心包封成纤维细胞(NIH-3T3)和人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)来模拟血管化基质组织,在壳层包封人结直肠腺癌细胞(Caco-2)来模拟肠上皮组织,进而在核-壳结构海藻酸凝胶微球中形成血管化肠粘膜体外组织模型。 在以w/w液滴为模板制备核-壳结构海藻酸钙3D凝胶微球支架及调控探究部分,通过控制流速,可将w/w液滴的核心直径与液滴直径的比值精确控制在0.27～0.86之间,以满足不同的封装需求。此外,通过表征核-薄壳结构3D凝胶微球支架的内部形貌,证明了支架内部具有明确的隔室化分区。之后,通过比较在普通3D支架和核-薄壳结构凝胶微球3D支架的核心中培养HUVEC的增殖和细胞分布情况,结果表明封装在具有疏松网络结构的核-薄壳结构凝胶微球3D支架核心中的HUVEC增殖更快,并且表现出成簇生长的细胞行为。最后,通过分别在核心和壳层封装HUVEC和Caco-2细胞来验证核-薄壳结构3D凝胶微球支架区室化封装异质细胞的能力。由此得出这种隔室尺寸可控并且能够区室化封装异质细胞的核-壳结构3D凝胶微球支架具有构建用于包封和培养多细胞类器官/组织的多功能生物载体的高潜力。 在核-薄壳结构海藻酸钙3D凝胶微球支架核心中构建血管化基质研究部分,探究了 NIH-3T3和HUVEC以固定的接种密度但不同的比例(0:1、2:1、4:1和8:1)所构建的3D共培养模型的血管化能力。其中,NIH-3T3和HUVEC比例为8:1时,NIH-3T3成功诱导HUVEC表现出出芽,迁移和形成脉管结构等细胞行为,展示了良好的血管化能力和在组织工程中规模化制备血管化微组织并与其他器官特异性细胞整合的巨大潜力。 在构建血管化肠粘膜体外组织模型研究部分,将Caco-2细胞和血管化基质细胞(NIH-3T3:HUVEC 8:1)分区隔室化包封在核-薄壳结构海藻酸钙3D凝胶微球支架的壳层和核心以形成血管化肠粘膜体外组织模型。通过对模型内细胞的活力,增殖,分布,细胞骨架形态,紧密连接蛋白表达和特征性生物标志物的分泌测定,证明了三重共培养模型中发生的细胞间相互作用增强了上皮细胞的增殖和活力,表现出上皮紧密连接蛋白的快速分化和P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多药耐药相关蛋白2(Multidrug Resistance Protein 2,MRP2)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)更高的功能表达,说明了这种血管化肠粘膜体外组织模型可以更准确地代表原生组织微环境,以更可靠的方式测试药物吸收。