编号：YYHY00960

篇名：基于金属-多酚网络的脂肪干细胞微球胶囊在皮肤再生中的应用

作者： 史一林

关键词： 干细胞微球; 微胶囊; 三维状态; 抗炎; 伤口愈合;

机构： 山东大学

摘要： 背景与目的: 颌面部烧伤、创伤和肿瘤常常带来颌面部皮肤的缺损,极大地影响患者的美观和生活质量。脂肪来源的间充质干细胞由于来源广泛、获取方便、具有多向分化能力和低免疫原性,因此在皮肤组织再生方面具有巨大潜力。与单层的间充质干细胞相比,三维间充质干细胞微球能更好发挥疗效,但是将间充质干细胞微球直接移植到体内仍然存在治疗效果不佳的问题,这可能与细胞微球受到外界不利刺激影响,迅速丧失三维结构有关。 为了解决这一问题,课题组前期将金属多酚网络(metal polyphenol network,MPN)材料包裹在牙周膜干细胞微球表面构建了牙周膜干细胞微球胶囊模型,系统的研究了MPN的抗氧化、抗菌和抗凋亡的特性,并证实MPN可以积极改善细胞微球的微生态环境,但课题组并未详细研究MPN材料对细胞微球自身抗炎性能的影响。本实验制备了脂肪来源的间充质干细胞微球(adipose derived stem cell spheroid,ADSC spheroid),将铁-单宁酸(ferrum-tannin,FeⅢ-TA)包裹在细胞微球表面构建脂肪干细胞微球胶囊(spheroid@[FeⅢ-TA]3),并进一步研究了 ADSC spheroid在MPN包裹下的三维状态和抗炎功能。 本课题主要包括以下研究内容:FeⅢ-TA涂层的表征及其对ADSC spheroid生物活性的影响;FeⅢ-TA涂层对 ADSC spheroid三维状态的影响;FeⅢ-TA涂层对ADSC spheroid体外抗炎功能和促进巨噬细胞向修复型巨噬细胞极化的影响及机制研究;利用小鼠皮肤缺损模型,验证spheroid@[FeⅢ-TA]3的增强的皮肤再生能力并研究其作用机制。 材料与方法: (1)Spheroid@[FeⅢ-TA]3的制备及生物活性检测。通过“单次自组装法”制备spheroid@[FeⅢ-TA]3胶囊;通过紫外-可见吸收光谱实验、扫描电子显微镜能量色散光谱实验和傅里叶变换红外光谱实验对FeⅢ-TA材料进行表征;通过细胞贴壁实验,研究FeⅢ-TA涂层的数量对 spheroid@[FeⅢ-TA]3贴壁的影响;构建了负载罗丹明B的spheroid@[FeⅢ-TA]3模型,通过共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)对FeⅢ-TA涂层进行观察;通过细胞计数试剂盒-8实验(cell counting kit-8,CCK-8),细胞流式凋亡实验体外检测ADSC的生物活性;最后通过小鼠皮下移植实验体内检测ADSC的生物活性。 (2)验证FeⅢ-TA涂层对ADSC spheroid三维状态和抗炎功能的影响及机制。将spheroid@[FeⅢ-TA]3播种在组织培养板上,通过相差显微镜和CLSM观察spheroid@[FeⅢ-TA]3的贴壁情况和三维状态;通过实时定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测细胞微球三维状态相关基因的表达;通过蛋白质微阵列和qRT-PCR,检测体外 spheroid@[FeⅢ-TA]3抗炎基因的表达和分泌,并用细胞培养上清液刺激巨噬细胞,检测spheroid@[FeⅢ-TA]3促进巨噬细胞向修复型巨噬细胞极化(Repair macrophage,M2 macrophage)的作用;最后通过RNA测序分析,研究FeⅢ-TA涂层对ADSC spheroid三维状态和抗炎功能影响的机制。 (3)验证 spheroid@[FeⅢ-TA]3对小鼠皮肤缺损愈合的作用及机制。将spheroid@[FeⅢ-TA]3植入到小鼠背部皮肤缺损处,观察其促进伤口愈合的效果;通过组织切片免疫荧光染色,观察spheroid@[FeⅢ-TA]3抗炎因子的分泌和促进小鼠巨噬细胞向M2型转化的作用。 结果: (1)构建了 ADSC spheroid胶囊,即spheroid@[FeⅢ-TA]3。紫外-可见吸收光谱实验、扫描电子显微镜能量色散光谱实验和傅里叶变换红外光谱实验表明FeⅢ-TA涂层在ADSC spheroid表面的成功包覆;CCK-8实验和细胞流式凋亡实验证明FeⅢ-TA涂层在体外对ADSC spheroid生物活性无显著影响(P>0.05);小鼠皮下移植实验证明FeⅢ-TA涂层在体内对ADSC spheroid生物活性无显著影响(P>0.05)。 (2)体外实验中,相较于native spheroid,spheroid@[FeⅢ-TA]3的三维球形状态维持时间更长(P<0.05),黏附相关基因的mRNA表达水平更低(P<0.05),抗炎因子白介素-1 受体拮抗剂(interleukin-1 receptor antagonist,IL-1RA)的 mRNA 表达和蛋白分泌更多(P<0.05),促进巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化的作用更明显(P<0.05)。RNA测序实验结果显示spheroid@[FeⅢ-TA]3的三维状态和抗炎基因相关通路表达上调。 (3)体内实验中,照片观察、组织切片 HE染色和Masson染色结果显示,spheroid@[FeⅢ-TA]3处理组小鼠皮肤愈合效果优于普通细胞球处理组和空白对照组(P<0.05);组织切片 IL-1RA和CD206免疫荧光染色实验显示,相较于普通细胞球,spheroid@[FeⅢ-TA]3可以更好的促进IL-1 RA分泌和促进小鼠巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化(P<0.05)。 结论: (1)FeⅢ-TA胶囊是一种生物相容性的材料,可以用来封装细胞微球。 (2)FeⅢ-TA胶囊可以延长ADSC spheroid的三维状态,同时增强其抗炎功能,从而促进小鼠皮肤伤口愈合。