编号：YYHY00980

篇名：多聚磷酸改性冻凝胶负载含介孔生物活性玻璃在止血和感染性创面修复中的作用研究

作者： 后起秀

关键词： 冻凝胶; 止血; 形貌结构; 单宁酸; 创面修复;

机构： 苏州大学

摘要： 背景:急性外伤、外科手术所造成的不规则创伤并发大出血是人类发生失血性休克乃至死亡的重要原因,对于发生在肘、肩、髋、膝等大关节以及肝、肾、脑等不可压缩器官的损伤出血,临床止血纱布难以迅速发挥止血疗效。除此之外,内科系统也会发生疾病、药物、遗传等相关的各种出凝血障碍问题。如再生障碍型贫血、急性早幼粒细胞白血病、特发性血小板减少性紫癜、骨髓增生异常综合征、血友病、鼠药中毒等,都会发生以出血为临床表现的并发症,治疗手段往往局限于外源性输注血小板、血浆输注、应用重组凝血因子VII、激素冲击疗法以及应用血小板生成素受体激动剂如艾曲波帕、阿伐曲波帕、罗米司亭等。但由于药物治疗起效慢、个体治疗效果差异明显、经济因素以及血液制品短缺和血小板体外保存周期短等不利因素限制,临床一线治疗面对如鼻腔出血、牙龈出血、体表外伤出血不止时往往只能选择止血纱布填塞或者明胶海绵填塞,但这两种止血材料因材质较硬而不能有效封堵伤口导致其疗效不佳。因此,针对创伤或出凝血功能异常的急性出血,设计一种新型止血敷料已成为临床医生迫切需要解决的问题。本研究以快速吸收液体、抗菌、合成便捷为设计目标,以便宜易购的天然成分,明胶（Gelatin）为载体制备了新型磷酸化改性冻凝胶（Cryogel）并加载了含单宁酸（Tannic acid,TA）与铜离子介孔生物活性玻璃（Copper ions mesoporous bioactive glasses,MBG-Cu）,得到负载含单宁酸的铜纳米颗粒磷酸改性冻凝胶（GP@MBG-Cu-TA）,研究其止血和抗菌作用,为临床创伤及病理性出血提供止血抗菌新材料。 目的:探究磷酸改性冻凝胶负载单宁酸与铜纳米生物活性玻璃后的止血、抗菌及伤口愈合效果。 方法:我们用甲基丙烯酸酐修饰明胶制得甲基丙烯酰明胶（Gelatin methacryloyl,Gel MA）冻凝胶,在Gel MA溶液中引入聚合咪唑磷酸（Imidazole-modified Poly P,Poly-Im）,冻干制得磷酸改性Gel MA冻凝胶（Gel MA-Phophate,GP）,通过核磁共振波谱表征GP冻凝胶结构;我们使用煅烧法制得MBG-Cu,将其混入到5%浓度的单宁酸溶液中,经过冻干制得含单宁酸的铜离子生物玻璃（MBG-Cu-TA）,通过扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）表征生物玻璃结构;将GP冻凝胶与MBG-Cu-TA共同浸泡过夜后冻干制得GP@MBG-Cu-TA。通过SEM、傅里叶红外光谱表征GP@MBG-Cu-TA冻凝胶结构,计算GP@MBG-Cu-TA的孔径率。选用NIH3T3细胞和冻凝胶浸出液共培养,使用细胞增殖实验（Cell Counting Kit-8,CCK-8）、活死细胞染色观察细胞生长状态来评估材料的生物相容性;选用Raw264.7细胞与浸出液共培养,利用免疫荧光染色在共聚焦显微镜下观察Raw264.7细胞形态来评估材料的免疫原性。通过体外孔板凝血实验、测算凝血指数、材料溶血实验、细菌集落形成实验考察GP@MBG-Cu-TA的体外止血、抗菌和血液相容性等功能。最后我们利用大鼠肝脏创伤出血模型、再生障碍型贫血（Aplastic anemia,AA）小鼠模型、A型血友病（Hemophilia A）小鼠模型,将GP@MBG-Cu-TA覆盖至大鼠肝脏创面出血处和凝血功能异常小鼠断尾伤口出血处,记录出血量和出血时间,评估GP@MBG-Cu-TA体内止血效果。同时通过H&E染色、ELISA测试评估复合水凝胶的体内组织相容性,在评估材料的抗菌性能时,我们建立小鼠全皮层缺损感染性伤口后应用材料,计算第7、14天伤口愈合率。 结果:（1）核磁共振氢谱1H与31P结果显示出的特征峰,证明成功实现了对Gel MA的磷酸化改性。与MBG相比,MBG-Cu-TA仍然为球形,直径为80至100nm之间,其形态、尺寸分布方面没有改变。（2）磷酸化改性后使得冻凝胶海绵由坚韧紧密变为蓬松柔软,孔径率增大（77.95±0.001%）,溶胀率增加（3991.0±2.25%）微观结构为疏松多孔结构。（3）添加MBG-Cu-TA后使得冻凝胶抑制了细菌集落形成,具有抗菌性。（4）NIH3T3细胞与材料浸出液共培养后发现细胞黏附性和增殖速度未发生明显改变,细胞形态呈梭形。（5）Raw264.7细胞与材料浸出液共培养后发现细胞形态呈圆形,未发生大面积坏死且细胞未发生极化。（6）体外凝血实验和含血冻凝胶的SEM照片显示GP@MBG-Cu-TA能吸收血液并截留血细胞,材料表面观察到大量红细胞、血小板和纤维蛋白形成。（7）凝血指数测试结果显示GP@MBG-Cu-TA组指数最低,达9.2±4.50%,证明其促进凝血速度最快。（8）在大鼠肝脏损伤模型中,GP@MBG-Cu-TA组能够显著降低出血量（156.17±44.64 mg）及出血时间（65.83±18.15 s）。（9）在小鼠断尾模型中使用GP@MBG-Cu-TA处理伤口,野生型小鼠（49.67±13.83 mg）、再生障碍性贫血模型小鼠（46.0±7.29 mg）与血友病模型小鼠（121.17±41.03 mg）均显示材料能降低出血量。在添加有金黄色葡萄球菌的皮肤损伤愈合模型中,GP@MBG-Cu-TA组在第14天的愈合率（第14天伤口面积/第0天伤口面积x100%）达1.24±0.35%,愈合率较对照组有显著性提高。 结论:使用磷酸化改性冻凝胶可以改变冻凝胶的物理性质,提高液体吸收速度。MBG-Cu-TA赋予了冻凝胶优异的抗菌性能。以天然明胶为基础合成的GP@MBG-Cu-TA冻凝胶具有良好的可降解性和生物安全性,合成简便,易于储存,GP@MBG-Cu-TA冻凝胶可以应用于出血伤口,促进局部凝血,在减少出血量的同时具备抗菌功能。