编号：YYHY00994

篇名：3D打印PU/n-HA掺杂介孔二氧化硅支架的骨免疫调节及成骨作用研究

作者： 王鹏

关键词： 骨组织工程; 骨免疫; 3D打印; 介孔二氧化硅; 纳米羟基磷灰石; 唑来膦酸;

机构： 四川大学

摘要： 由于创伤、肿瘤、先天畸形或衰老等原因造成的骨组织缺损是临床治疗难点之一,公认治疗的金标准是自体骨移植,但由于供区骨量的限制,骨组织仍存在巨大的临床缺口。随着技术的发展和成熟,骨组织工程(Bone tissue engineering,BTE)材料成为骨组织缺损的修复有效策略,但在临床应用的过程中也仍有很多问题亟待解决,构建性能和结构优良的组织工程支架材料仍然是BTE研究的重点。 成骨细胞在骨组织修复过程中发挥了重要的作用,BTE材料的设计理念之一便是促进细胞的成骨分化能力。虽然在促进成骨分化中取得了一定的成果;但是很多研究体外和体内的结论并不一致,随着研究的深入,发现BTE材料与宿主之间的免疫反应可以对骨组织的修复效果产生影响。作为一种外来异物,BTE材料植入体内以后会引起宿主局部环境的免疫炎症反应,材料与宿主免疫系统的相互作用因为受到很多因素影响,往往是不可控的,这也影响了 BTE材料的骨组织修复效果。因此,在BTE材料设计阶段通过靶向修饰来调节免疫细胞的功能是BTE材料未来的发展方向之一。为了构建一种既可以促进成骨又可以调节宿主免疫细胞功能的多功能支架材料,我们进行了相关探索。 纳米羟基磷灰石(Nano-hydroxyapatite,n-HA)与组成人体硬组织的无机成分相似,被广泛的应用于BTE材料中。但是n-HA脆性高的特性不利于材料的稳定和成型,通常与其他聚合物以复合物的形式用于BTE当中。本研究选用生物相容性好的聚氨酯(polyurethane,PU)弹性体作为介质与n-HA进行复配,两者可以实现性能的互补。研究表明介孔二氧化硅对免疫细胞特别是巨噬细胞的极化具有一定的调节作用。为进一步探索材料对免疫细胞的调节功能,我们在PU/n-HA复配的基础上引入了介孔二氧化硅,期望通过对免疫巨噬细胞的调控改善局部免疫微环境,促进组织缺损的修复。 骨稳态的维持有赖于成骨细胞和破骨细胞正常功能的发挥。BTE材料植入后的炎症反应过程中释放的炎症因子可以诱导破骨细胞的成熟,破骨细胞功能亢进将对骨组织缺损的修复产生负面效果,在骨修复过程中可以对破骨细胞的功能进行调控从而促进骨组织缺损的修复。唑来膦酸作为一种治疗骨质疏松的双膦酸盐类药物,可以抑制破骨细胞形成,临床中更多的是用于治疗骨质疏松;但是,在骨组织缺损修复过程中通过使用低剂量唑来膦酸调控破骨细胞功能来促进骨组织修复的相关研究较少,其效果和安全性仍有待进一步探索研究。 研究目的:本研究旨在充分发挥3D打印的制备优势的基础上,从调节成骨细胞、破骨细胞、免疫细胞功能的角度对材料体系进行优化,制备一种具有多角度调控功能的BTE支架体系;在纳米羟基磷灰石与聚氨酯复配的基础上,通过掺杂介孔二氧化硅对材料性能进一步改进,探索其对巨噬细胞极化以及骨组织缺损修复的影响;同时探究使用低剂量唑来膦酸调控破骨细胞的功能对骨组织修复的影响,为BTE材料在骨组织缺损中的修复提供一种新的思路和方法。 材料和方法: 1.3D打印PU/n-HA掺杂介孔二氧化硅支架的制备与表征 制备完n-HA之后,结合介孔二氧化硅,通过3D打印的方式制备多孔支架,然后通过扫描电子显微镜察表面形貌,通过能谱分析检测各组分在支架中的分布情况,通过傅立叶变换红外吸收光谱仪和X射线衍射仪进一步对支架进行结构表征,利用万能材料试验机对支架的力学性能进行测试,并通过接触角测试进一步对支架的亲水性进行验证。 2.3D打印PU/n-HA掺杂介孔二氧化硅支架骨免疫调节作用及不同浓度唑来膦酸对破骨细胞形成的影响 通过将3D打印支架与RAW264.7细胞共培养一段时间后,利用流式细胞术检测巨噬细胞的极化状态;运用LPS对RAW264.7进行诱导后通过与支架材料共培养的方式对巨噬细胞极化进行干预,通过qRT-PCR检测巨噬极化相关基因和Western Blot对极化相关蛋白的表达,评估支架组分对巨噬细胞极化的影响;使用低剂量唑来膦酸对RANKL诱导破骨细胞的过程进行干预,通过Western Blot对破骨细胞的相关蛋白进行检测,验证抑制破骨细胞形成的最适唑来膦酸剂量。 3.3D打印PU/n-HA掺杂介孔二氧化硅支架体外细胞生物学相容性及体外成骨作用研究 3.1使用含有三种不同浓度唑来膦酸的培养基培养BMSCs和RAW264.7细胞通过CCK-8和LIVE/DEAD染色探究不同浓度的唑来膦酸对细胞生存率的影响; 3.2通过将材料与BMSCs和RAW264.7细胞进行共培养通过LIVE/DEAD和F-actin、DAPI染色检测材料对细胞生存和形态的影响; 3.3通过材料与RAW264.7细胞共培养制备成骨诱导条件培养基,探究材料对BMSCs细胞向成骨分化的影响,通过qRT-PCR、Western Blot、ALP和茜素红染色探究成骨分化相关标志物的表达情况; 3.4通过将支架材料与大鼠血管内皮细胞体外共培养,探究支架组分对血管内皮细胞成管的影响。 4.3D打印PU/n-HA掺杂介孔二氧化硅支架骨缺损修复的体内实验研究 4.1通过拔除大鼠上颌磨牙配合低剂量唑来磷酸同期使用,采用Micro-CT扫描和组织学检测探究较低剂量唑来膦酸的使用对大鼠牙槽窝愈合的影响; 4.2通过构建大鼠股骨骨组织缺损模型,在缺损中植入多孔支架,植入术后预定时间内取材,利用Micro-CT和组织学染色以及免疫组化染色探究骨组织缺损的修复情况,通过qRT-PCR和ELISA分别检测骨缺损周围组织和血清中炎症因子的表达情况,进一步运用免疫组化染色探究组织细胞的炎症反应情况。 研究结果: 1.通过3D打印制备的PU/n-HA掺杂介孔二氧化硅支架各组分在支架体系中均匀分布,支架均一性好,介孔二氧化硅的加入使支架材料的杨氏模量提高了约 36.6%; 2.3D打印PU/n-HA掺杂介孔二氧化硅支架可以调节巨噬细胞的极化,含有介孔二氧化硅的PHS组和含有介孔二氧化硅及唑来膦酸的PHSZ组可以诱导巨噬细胞M2抗炎表型分化,促进抗炎因子的释放;1×10-5mol/L浓度的唑来膦酸在不影响成骨的同时,可以抑制破骨细胞相关蛋白的表达; 3.体外细胞实验表明,3D打印PU/n-HA掺杂介孔二氧化硅支架具有良好的细胞相容性,体外成骨诱导实验证明,掺杂介孔二氧化硅可以促进成骨相关基因和蛋白的表达,1 × 10-5mol/L浓度的唑来膦酸的使用对骨髓间充质干细胞和RAW264.7细胞的生长没有明显的抑制作用;支架材料可以有效促进血管内皮细胞体外成管效果,唑来膦酸的加入对血管内皮细胞成管能力没有明显的抑制作用; 4.体内动物实验表明,低浓度唑来膦酸注射同期与大鼠上颌磨牙拔除实验表明,唑来膦酸不影响拔牙窝的修复效果;3D打印PU/n-HA掺杂介孔二氧化硅支架可以有效的促进大鼠股骨缺损的修复,介孔二氧化硅的使用可以有效调节骨缺损周围的免疫微环境,促进抗炎细胞因子的释放。 综上所述,在PU/n-HA的基础上掺杂介孔二氧化硅可以有效地改善3D打印支架的力学性能,通过对成骨细胞、免疫细胞、破骨细胞等多角度出发对材料进行优化改性,可以实现对巨噬细胞极化的调节,促进抗炎因子的释放,有效促进成骨相关标志物的表达从而实现促进成骨、成血管的效果。1×10-5mol/L的唑来膦酸可以有效抑制破骨细胞的形成,通过对免疫细胞极化的调节,促进成骨细胞分化和抑制破骨细胞功能协同促进了骨组织缺损的修复效果。为包括颌骨在内的骨组织缺损提供一种新的思路和选择,也为临床中低剂量使用唑来膦酸用于骨组织缺损修复的可行性提供一定的参考。