编号：YYHY00996

篇名：介孔生物活性玻璃/仿生多肽复合体构建及其牙本质修复作用研究

作者： 陆君卓

关键词： 生物活性玻璃; 釉原蛋白; 仿生多肽; 载药; 成牙本质向分化;

机构： 四川大学

摘要： 背景:目前对于深龋的修复方式及治疗药物均十分有限。由于深龋破坏同时涉及硬组织的脱矿和深层牙体组织的崩解,因此理想的深龋修复应包含硬组织的再矿化以及牙本质的修复性再生。在前期研究中,我们创新性地设计合成了釉原蛋白衍生多肽QP5,已证实其在体内外均具备良好的钙磷吸附及硬组织再矿化功能,且最新研究发现该多肽还对牙髓细胞有良好的细胞学效应。然而,由于多肽在复杂的口腔环境中易被稀释降解,难以维持药效浓度,且用于再矿化时还缺乏钙磷来源,在进一步应用时仍需对这类材料进行有效的药物复合及递送。在众多的载体中,生物活性玻璃因具有良好的钙磷储备性、界面结合性及载药释药性能,在作为各类生物活性分子的载体方面表现出明显优势。而介孔生物活性玻璃(MBG)具有充足的钙磷储备、可控的刺激响应性药物释放特征和良好的生物活性,有潜力用于QP5的搭载并与之协同在深龋发挥双效应。 目的:基于釉原蛋白衍生多肽QP5引导硬组织矿化优势和促进牙髓细胞生物矿化的潜能,借助生物活性玻璃的载药性、界面结合性及钙磷储备性,构建介孔生物活性玻璃/仿生多肽QP5复合体,检测复合体的载药释药性能,探究其对人牙髓细胞行为的影响及在体内原位修复牙本质效果,为多肽类生物大分子药物应用于深龋的双效应修复奠定理论基础。 方法: 1.采用溶胶-凝胶法制备非介孔生物活性玻璃(NBG),在此基础上结合模板法制备介孔生物活性玻璃(MBG),并通过SEM、TEM与氮气吸附实验等手段进行表征。通过Fmoc-固相肽化学方法合成并纯化QP5多肽,通过圆二色谱及高效液相色谱分析该多肽在不同p H溶液中的稳定性。分别使用两种生物活性玻璃与QP5复合,比较其包封率及载药量。进一步结合FTIR、XPS检测手段验证复合体构建成功,筛选出成功搭载QP5的复合体。 2.使用不同浓度多肽与MBG复合,通过比较包封率与载药量筛选出MBG与QP5的最佳配比。进一步分别对MBG及QP5进行电性修饰,筛选可有效提高复合体载药量的修饰方式。将复合体在不同p H(7.4、5.5、4.0)条件下进行释药,使用紫外分光光度计检测多肽释放量,通过甲基百里酚蓝法测量钙释放量,通过磷钼酸法测量磷释放量,设置短期检测节点(0～12 h)及长期检测节点(1～8 d)以观测复合体的药物释放特征。 3.体外提取人牙髓细胞,利用CCK-8实验检测MBG/QP5对h DPCs的毒性作用并筛选出最适作用浓度。采用细胞划痕实验检测梯度浓度MBG/QP5复合体对h DPCs迁移能力的影响。制备复合体包被的人牙本质样本,通过SEM观察复合体对牙本质的吸附,通过CLSM观察h DPCs对不同处理组牙本质的粘附情况。配制含MBG/QP5复合体的矿化诱导培养基并与h DPCs共培养,采用ALP染色和茜红素染色分析复合体对h DPCs碱性磷酸酶活性及矿化程度的影响。提取各实验组细胞RNA,采用实时荧光定量PCR检测h DPCs矿化相关基因(ALP,COL1,DSPP,RUNX2,OCN,OPN)转录水平的变化,评价MBG/QP5复合体诱导h DPCs成牙本质向分化效果。 4.制备FITC标记的QP5多肽与MBG/QP5复合体,分别使用激光共聚焦显微镜、流式细胞术及细胞透射电镜检测复合体入胞情况。分别使用氯丙嗪,阿米洛利,甲基-β-环糊精和4°C培养预处理细胞,检测复合体及多肽的入胞通路。在多肽及复合体入胞后移除药物,通过流式细胞术观察第2～48 h后胞内药物留存情况。 5.选择SD大鼠为实验动物,将MBG/QP5复合体应用于大鼠上颌第一磨牙,以构建用于研究复合体在体内应用效果的动物模型。监测大鼠体重,4周观察期后采集大鼠血液进行血常规、血生化分析,对肝肾行H&E染色,以评估复合体在体内应用的生物安全性。采集上颌磨牙并利用Micro-CT进行硬组织影像学分析,通过H&E染色进行牙髓及第三期牙本质形成情况的组织学分析。 结果: 1.MBG/QP5复合体成功构建及优化:成功制备了具有高度有序介孔结构与高比表面积的MBG,可通过内部有序规律介孔结构及静电吸附载入QP5;MBG/QP5复合体中保留了QP5的特征性活性基团与功能元素,证实了MBG/QP5复合体的成功构建。多肽的初始浓度影响了复合体的包封率与载药量,1.5 mg/m L的QP5初始浓度是综合载药效能与经济性价比的最适配方;调整载药体系p H至QP5等电点以下可使MBG和QP5之间产生更强的静电吸附,在维持QP5初始浓度不变的情况下进一步提高MBG/QP5复合体的载药量。 2.MBG/QP5复合体可实现p H响应性的双重药物递送:复合体的释药曲线呈先大量突释后长期缓释,其中钙磷离子在p H为4.0时具有最高释放量,而QP5在p H为7.4时具有最高释放量;酸性p H下MBG的溶解导致钙磷离子与多肽快速释放,并上调环境p H,引发QP5多肽进一步大量解离并释放,以受控的方式完成p H响应性的层级释药。 3.MBG/QP5复合体具有良好的细胞生物学效应:复合体对人牙髓细胞具有良好的细胞相容性,100μg/m L及以下浓度的复合体颗粒可用于长期的细胞培养。复合体呈时间及浓度依赖性地促进h DPCs的迁移;复合体对牙本质有良好的的亲和性,对脱矿的牙本质小管产生一定封闭作用;复合体可促进h DPCs对牙本质的粘附,并提高其碱性磷酸酶活性,诱导生物矿化结节的产生,上调细胞成牙本质向分化及矿化相关基因的表达,且效果优于相同浓度的单一成分(MBG或QP5),在牙本质-牙髓细胞界面具有良好的细胞生物学调控作用。 4.MBG/QP5复合体可被牙髓细胞主动摄取并维持多肽胞内浓度:复合体及多肽均可被h DPCs依靠ATP消耗的主动方式进行细胞摄取,其摄取呈浓度及时间依赖性。多肽通过网格蛋白介导的途径被牙髓细胞内化,并受到细胞膜脂筏调节;复合体除以上两条入胞通路外,还可以通过巨胞饮作用被摄取。移除药物后,复合体相较于单独应用多肽能更长时间维持胞内QP5浓度。 5.MBG/QP5复合体成功诱导修复性牙本质再生:成功构建MBG/QP5复合体内应用的SD大鼠直接盖髓动物模型,复合体在体内应用4周后对大鼠体重、血常规、血液生化及肝肾均无明显损害,复合体在体内应用具有良好的生物安全性。复合体在穿髓孔处成功诱导了规则的桥梁状修复性牙本质层,对穿髓孔形成物理和生物双重封闭,保护了深部的牙髓组织。 结论:利用具有有序介孔的MBG及修饰表面电性的QP5可成功制备具有深龋修复双效应潜能的MBG/QP5复合体,此复合体弥补了单独应用多肽时钙磷来源不足、界面封闭性差的缺陷,并可在酸性环境实现p H响应性的双重药物递送。MBG/QP5复合体可促进牙髓细胞迁移与粘附,调控细胞成牙本质向分化,在体内原位诱导修复性牙本质再生。此复合体的构建为蛋白多肽类生物大分子药物递送提供了技术参考,同时也为深龋的仿生修复提供了新策略,未来有望在深龋的临床防治中发挥优异的生物学潜能。