应用
背景:OA(Osteoarthritis,骨性关节炎)是一种慢性退行性关节疾病,其主要特征是关节软骨的进行性破坏,OA的发病机制受多种危险因素的影响,包括年龄、肥胖、性别、遗传易感性和创伤,晚期OA引起的关节功能障碍被认为是老年人残疾的主要原因,这给社会造成了巨大的经济负担。目前,临床治疗OA的药物还是以缓解疼痛症状为主,拮抗软骨退变的药物临床疗效并不确切,因此需要开发新的药物及其递送方式用于OA的临床治疗。 目的:(1)设计一种高效的褪黑素-壳聚糖微球载药体系;(2)建立人软骨细胞体外培养体系;(3)从体外细胞层面验证微球对人软骨细胞凋亡的拮抗作用。 方法:利用喷雾干燥法制作MT-CS,通过粒径分析仪、分光光度计、扫描电子显微镜对微球进行表征分析;提取进行全膝关节置换的OA患者膝关节软骨细胞培养,构建人软骨细胞OA模型,使用CCK-8法检测软骨细胞增殖情况;在构建的人软骨细胞OA模型上进行分组干预,通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测软骨细胞上清液中肿瘤坏死因子-α、基质金属蛋白酶-13含量,Western Blot法检测软骨细胞中二型胶原的蛋白表达。 结果:利用喷雾干燥法制作的MT-CS具有较好的包封及载药率,在体外实验中,新构建的MT-CS较普通MT对人软骨细胞凋亡的拮抗作用明显增强。 结论:本实验设计优化了褪黑素壳聚糖微球的制作方法,并且在体外人软骨细胞OA模型中证实其具有较好的拮抗软骨细胞凋亡效果,为OA治疗的策略提供新思路。 ...
目的:基于微流控技术,选用PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid),聚乳酸-羟基乙酸共聚物)高分子聚合物作为药物载体,负载GEF(Gefitinib,吉非替尼),构建GEF-PLGA载药微球,考察其载药效率、释放性质,并验证在肺癌细胞系和荷瘤小鼠上的抗肿瘤效果,为这种新型缓释载药微球的进一步临床转化提供科学依据。 方法:使用微流控技术制备GEF-PLGA载药微球,通过光镜、扫描电镜观察载药微球的形态、大小及粒径相关性。测量并研究GEF-PLGA载药微球的包封率载药率,测定体外缓释曲线,同时通过CCK8(Cell Counting Kit-8)实验及荧光染色法在PC-9肺癌细胞系上验证GEF-PLGA载药微球的抗肿瘤疗效。最后对荷瘤小鼠的肿瘤组织使用HE(Hematoxylin-eosin,苏木精-伊红)染色和免疫组化检测相关分子标志物,进一步验证抗肿瘤效果。 结果:我们成功制备了GEF-PLGA载药微球,通过光镜及电镜观察,其为表面带有小孔隙的圆形,粒径约为90μm,包封率约为95.16±1.35%;载药率约为19.17±0.20%;体外缓释曲线表明载药微球在体外可持续释放约15天,总释放药量65%左右。通过体外细胞抗肿瘤实验,发现GEF-PLGA载药微球生物相容性高,与微球共培养三天后PC-9细胞相对活力约30%,在荷瘤小鼠实验中,我们发现空白载药微球对肿瘤生长基本没有抑制作用,说明PLGA载药微球具有安全性,同时GEF-PLGA载药微球对于肿瘤的杀伤效果强于GEF裸药,HE染色和免疫组化定量结果进一步验证了载药微球抗肿瘤效果优于裸药。 结论:本研究通过微流控技术制备出了高包封率及高载药率的载药微球,GEF-PLGA载药微球在体内外实验中都显示出了良好的抗肿瘤效果,并在体内疗效评价中证实了相对于裸药的优越性。 ...
目的:以透明质酸(HA)为原料,在此基础上进行材料改性,通过微流控技术制备改性甲基丙烯酰化透明质酸(Hyaluronic acid Methacryloyl,HAMA)微球,利用化学键接枝负载白细胞介素-1受体拮抗剂(interleukin-1 receptor antagonist,IL-1 Ra)的BSA纳米粒(BSA nanoparticle,BNP),从而构建一种具有pH响应性能的水凝胶微球,研究其在治疗退变椎间盘中的作用。 方法:首先利用高碘酸钠与HA反应,获得醛基化透明质酸(Aldehyde-based hyaluronic acid,AHA)。随后加入甲基丙烯酸酐(methacrylic anhydride,MA)后,得到纯净的醛基化甲基丙烯酰化透明质酸(Aldehyde-based methacrylated hyaluronic acid,AHAMA)。通过微流控装置制备出单分散微球,与负载IL-1 Ra的纳米粒通过席夫碱化学键接枝,从而得到具有pH响应性能的改性HAMA微球(Modified MS)。通过光学显微镜、扫描电镜、能谱仪、傅立叶红外光谱、粒度仪、酶联免疫吸附试验等对微球进行表征测定。本研究体外实验中所使用的大鼠髓核细胞(Nucleus pulposus cells,NPCs)提取自大鼠尾椎椎间盘,通过活/死染色及CCK-8实验评价所制备材料的生物相容性。采用免疫荧光、Western Blot等方法评价在酸性条件下IL-1Ra的治疗作用。最后,对大鼠进行体内动物实验,通过X线、MRI等影像学技术,研究大鼠椎间盘高度和信号强度的改变。于手术后第4和第8周取出标本后,行H&E、番红固绿色染色及组织学染色,从组织学水平评价改性HAMA微球对椎间盘的修复修复。 结果:本研究采用微流控技术,获得了尺寸均一、可响应pH改变调整释放药物速率的改性HAMA微球。通过活/死染色与CCK-8实验,证实了改性HAMA微球的生物相容性良好,并可促进髓核细胞的增殖。通过免疫荧光、蛋白质印迹等方法,证实了改性HAMA微球具有抗炎、促进ECM修复的效果。动物实验中,影像学与组织学结果表明,Modified MS组显著优于其他实验组,术后4周、8周结果与NC组相比均无统计学差异,表明Modified MS组的椎间盘再生能力优异。 结论:成功制备联合IL-1 Ra的pH响应型改性HAMA微球,其能够缓慢释放IL-1 Ra,具有良好的生物相容性,在体外酸性环境下能持续抑制炎症反应,恢复细胞外基质。在体内促进退变大鼠椎间盘再生效果显著。因此,本课题组制备的联合IL-1 Ra的pH响应型改性HAMA微球为椎间盘炎症微环境下生物材料的再生应用提供了一种新的治疗策略。 ...
背景与目的: 颌面部烧伤、创伤和肿瘤常常带来颌面部皮肤的缺损,极大地影响患者的美观和生活质量。脂肪来源的间充质干细胞由于来源广泛、获取方便、具有多向分化能力和低免疫原性,因此在皮肤组织再生方面具有巨大潜力。与单层的间充质干细胞相比,三维间充质干细胞微球能更好发挥疗效,但是将间充质干细胞微球直接移植到体内仍然存在治疗效果不佳的问题,这可能与细胞微球受到外界不利刺激影响,迅速丧失三维结构有关。 为了解决这一问题,课题组前期将金属多酚网络(metal polyphenol network,MPN)材料包裹在牙周膜干细胞微球表面构建了牙周膜干细胞微球胶囊模型,系统的研究了MPN的抗氧化、抗菌和抗凋亡的特性,并证实MPN可以积极改善细胞微球的微生态环境,但课题组并未详细研究MPN材料对细胞微球自身抗炎性能的影响。本实验制备了脂肪来源的间充质干细胞微球(adipose derived stem cell spheroid,ADSC spheroid),将铁-单宁酸(ferrum-tannin,FeⅢ-TA)包裹在细胞微球表面构建脂肪干细胞微球胶囊(spheroid@[FeⅢ-TA]3),并进一步研究了 ADSC spheroid在MPN包裹下的三维状态和抗炎功能。 本课题主要包括以下研究内容:FeⅢ-TA涂层的表征及其对ADSC spheroid生物活性的影响;FeⅢ-TA涂层对 ADSC spheroid三维状态的影响;FeⅢ-TA涂层对ADSC spheroid体外抗炎功能和促进巨噬细胞向修复型巨噬细胞极化的影响及机制研究;利用小鼠皮肤缺损模型,验证spheroid@[FeⅢ-TA]3的增强的皮肤再生能力并研究其作用机制。 材料与方法: (1)Spheroid@[FeⅢ-TA]3的制备及生物活性检测。通过“单次自组装法”制备spheroid@[FeⅢ-TA]3胶囊;通过紫外-可见吸收光谱实验、扫描电子显微镜能量色散光谱实验和傅里叶变换红外光谱实验对FeⅢ-TA材料进行表征;通过细胞贴壁实验,研究FeⅢ-TA涂层的数量对 spheroid@[FeⅢ-TA]3贴壁的影响;构建了负载罗丹明B的spheroid@[FeⅢ-TA]3模型,通过共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)对FeⅢ-TA涂层进行观察;通过细胞计数试剂盒-8实验(cell counting kit-8,CCK-8),细胞流式凋亡实验体外检测ADSC的生物活性;最后通过小鼠皮下移植实验体内检测ADSC的生物活性。 (2)验证FeⅢ-TA涂层对ADSC spheroid三维状态和抗炎功能的影响及机制。将spheroid@[FeⅢ-TA]3播种在组织培养板上,通过相差显微镜和CLSM观察spheroid@[FeⅢ-TA]3的贴壁情况和三维状态;通过实时定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测细胞微球三维状态相关基因的表达;通过蛋白质微阵列和qRT-PCR,检测体外 spheroid@[FeⅢ-TA]3抗炎基因的表达和分泌,并用细胞培养上清液刺激巨噬细胞,检测spheroid@[FeⅢ-TA]3促进巨噬细胞向修复型巨噬细胞极化(Repair macrophage,M2 macrophage)的作用;最后通过RNA测序分析,研究FeⅢ-TA涂层对ADSC spheroid三维状态和抗炎功能影响的机制。 (3)验证 spheroid@[FeⅢ-TA]3对小鼠皮肤缺损愈合的作用及机制。将spheroid@[FeⅢ-TA]3植入到小鼠背部皮肤缺损处,观察其促进伤口愈合的效果;通过组织切片免疫荧光染色,观察spheroid@[FeⅢ-TA]3抗炎因子的分泌和促进小鼠巨噬细胞向M2型转化的作用。 结果: (1)构建了 ADSC spheroid胶囊,即spheroid@[FeⅢ-TA]3。紫外-可见吸收光谱实验、扫描电子显微镜能量色散光谱实验和傅里叶变换红外光谱实验表明FeⅢ-TA涂层在ADSC spheroid表面的成功包覆;CCK-8实验和细胞流式凋亡实验证明FeⅢ-TA涂层在体外对ADSC spheroid生物活性无显著影响(P>0.05);小鼠皮下移植实验证明FeⅢ-TA涂层在体内对ADSC spheroid生物活性无显著影响(P>0.05)。 (2)体外实验中,相较于native spheroid,spheroid@[FeⅢ-TA]3的三维球形状态维持时间更长(P<0.05),黏附相关基因的mRNA表达水平更低(P<0.05),抗炎因子白介素-1 受体拮抗剂(interleukin-1 receptor antagonist,IL-1RA)的 mRNA 表达和蛋白分泌更多(P<0.05),促进巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化的作用更明显(P<0.05)。RNA测序实验结果显示spheroid@[FeⅢ-TA]3的三维状态和抗炎基因相关通路表达上调。 (3)体内实验中,照片观察、组织切片 HE染色和Masson染色结果显示,spheroid@[FeⅢ-TA]3处理组小鼠皮肤愈合效果优于普通细胞球处理组和空白对照组(P<0.05);组织切片 IL-1RA和CD206免疫荧光染色实验显示,相较于普通细胞球,spheroid@[FeⅢ-TA]3可以更好的促进IL-1 RA分泌和促进小鼠巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化(P<0.05)。 结论: (1)FeⅢ-TA胶囊是一种生物相容性的材料,可以用来封装细胞微球。 (2)FeⅢ-TA胶囊可以延长ADSC spheroid的三维状态,同时增强其抗炎功能,从而促进小鼠皮肤伤口愈合。 ...
本文通过热注入法和水热法合成了掺杂锌的AgInS2（ZAIS）与AgInSe2/ZnS量子点,深入研究了ZAIS量子点在光动力治疗（PDT）领域的应用潜力。通过热注入法制备的ZAIS量子点具有高荧光量子产率（PLQY）和长荧光寿命。在研究中,我们通过XRD、TEM、吸收和荧光光谱等表征手段研究了不同Ag/In比例、Zn含量及S含量对ZAIS量子点荧光性能的影响,并通过优化制备条件,成功获得了荧光性能优异的量子点,当Ag:In为1:3、Zn含量20%、S含量33%时,PLQY达到72.36%。通过两亲性聚合物PMAO对ZAIS进行表面包覆,改善了其生物相容性和水溶性。ZAIS/PMAO优异的荧光性能及在光照激发（420 nm,20 W）下产生单线态氧的能力,使其能够作为荧光探针对肿瘤细胞成像并用于PDT。实验结果表明,ZAIS/PMAO在光照下能够显著诱导癌细胞和细菌的死亡。此外,我们还通过水热法直接合成了水溶性AgInSe2/ZnS QDs,尽管量子产率较低,但具有良好的生物相容性、优异的荧光性能。在光照条件（420nm,20 W）下,水溶性AgInSe2/ZnS QDs对癌细胞与细菌具有抑制作用。最后,为了进一步提高PDT的疗效,我们将ZAIS QDs与光敏剂氨基四苯基卟啉（TAPP）结合,成功制备了ZAIS/PMAO-g-TAPP荧光微球。我们研究了TAPP接枝率对于ZAIS/PMAO-g-TAPP的PDT效果的影响,发现TAPP接枝率为10%相较于1%具有更好的PDT效果。实验结果表明ZAIS/PMAO-g-TAPP（10%）具有很低的细胞毒性,当浓度2.8 mg/mL以下时,细胞存活率均在95%以上。在PDT实验中,当ZAIS/PMAO-g-TAPP浓度达到1.7 mg/mL时,细胞存活率降低至10%以下,对癌细胞的杀伤效果明显。细菌实验中,光照与ZAIS/PMAO-g-TAPP对细菌的影响很小,在ZAIS/PMAO-g-TAPP与光照共同作用时,细菌存活率显著降低,当ZAIS/PMAO-g-TAPP浓度为2.3 mg/mL时,细菌存活率仅有6.2%。将ZAIS QDs与光敏剂结合的方法显著提高了PDT的疗效,为肿瘤的早期诊断和治疗提供新的思路和方法。 ...
在当前临床实践中,骨缺损是一种常见疾病,严重影响患者的健康状况。严重的骨缺损需要进行骨组织重建以进行修复。自体骨移植和异体骨移植被认为是目前最常见的骨组织重建的方法。然而,这些方法存在着移植来源有限、并发症发生率高等局限性。因此,近几十年来,组织工程技术在研究骨缺损治疗方法中逐渐展现出前景。组织工程的一个重要目标是设计和制造可吸收和可生物降解的支架,以促进新生骨组织的形成并长期维持组织结构的完整性。不同类型的微球、聚合物和复合材料支架已被应用于骨再生治疗中。在骨再生过程中,微球因其独特的形状和结构与骨骼中的骨基质囊泡相似,可以为新骨的形成提供良好的环境。然而,骨基质囊泡通常被认为是人体骨骼组织生物矿化的主要部位。因此,本文旨在通过构建仿生基质小泡,利用静电喷雾法制备海藻酸钠微球(ALG)、海藻酸钠-黑磷(ALG-BP)复合微球以及负载MC3T3-E1细胞的海藻酸钠-黑磷(ALG-BP)复合微球,分别用于骨缺损的治疗。本文的主要研究结果如下: (1)利用静电喷雾(Electrostatic spray,ES)技术将海藻酸钠(ALG)与黑磷纳米片(BPNS)混合,合成了一种新型复合微球。在生物矿化过程中,这些微球在暴露于仿生矿化液(SBF)时可模拟基质囊泡的调节功能。通过调节不同的矿化时间探究微球最短生成羟基磷灰石速度,以达到快速矿化的目的,减少骨治疗的时间。结果显示,矿化2 h的海藻酸钠(ALG)-黑磷纳米片(BPNS)新型复合微球表面生成大量羟基磷灰石(HA),为后续的实验奠定了基础。 (2)在生物矿化过程中,这些微球暴露于SBF中可模拟基质囊泡的调节功能。通过煅烧实验结果和TG-DSC结果显示,BPNS在一定程度上促进了微球表面HA的生成。细胞毒性实验和细胞增殖实验显示,细胞增值活力超过85%。此外,伤口愈合评估显示,M-ALG-BP微球具有卓越的迁移能力,迁移率超过50%。此外,经过7天的成骨诱导后,M-ALG-BP微球明显刺激了成骨细胞的分化。尤其值得注意的是,M-ALG-BP微球能显著增强成骨细胞的成骨分化,并诱导体外胶原蛋白的产生。此外,微球植入小鼠骨骼肌的实验表明,ALG-BP微球具有异位矿化的潜力。这项研究强调了ALG-BP微球出色的矿化特性及其在骨组织工程中的临床应用前景。 (3)利用ES技术,制备了负载MC3T3-E1细胞的ALG-BP复合微球。通过DAPI染色和细胞毒性实验结果表明:MC3T3-E1细胞成功负载进入ALG微球和ALG-BP复合微球内部,并且活/死染色进一步证明在ALG微球和ALG-BP微球内部的细胞,在5天后仍能保持良好的活性。BP的引入对细胞无毒。此外,在大鼠股骨平台建立骨缺损模型,随后将ALG微球和负载MC3T3-E1细胞的ALG-BP复合微球植入骨缺损处,通过体内实验结果显示:相比ALG微球来说,ALG-BP@MC3T3-E1微球可以更快促进骨骼生长。 本研究通过将BPNS与ALG结合制备微球,并调节矿化时间,探索了最短的矿化时间,并进一步证实了BP具有促进矿化的潜力。通过将ALG-BP微球植入体内,证明了微球具有异位矿化的潜力,为骨缺损的修复提供了有价值的数据和结果。最后,通过将MC3T3-E1细胞封装在ALG-BP微球中,并进行动物实验证明,ALG-BP@MC3T3-E1微球能够促进新骨的生成。综上所述,本研究为未来骨组织工程研究提供了有益的思路和方法。 ...
应用
目的:以大豆卵磷脂(SL)为介质,包被骨形态发生蛋白(BMP-2)(SL@BMP-2)。并基于微流控装置,将SL@BMP-2溶于左旋聚乳酸(PLLA)溶液,制备BMP-2功能化的可注射多孔微球(MS@SL@BMP-2),研究其促骨再生作用。 方法:首先,将SL与BMP-2工作液充分混合,搅拌均匀,形成均一溶液(SL@BMP-2)。接着,将SL@BMP-2加入溶有PLLA的二氯甲烷(DCM)溶液中,再次充分搅拌均匀。最后加入明胶溶液,利用乳液法,基于微流控装置制备BMP-2功能化的可注射多孔微球(MS SL@BMP-2)。针对这一功能化微球,我们前后行扫描电子显微镜(SEM)、粒径分析、孔径分析、免疫荧光等方法分析微球形态、载药效率、药物分布及释放等。体外试验方面,我们提取大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),利用CCK-8、活/死染色评估微球生物相容性,考察其对BMSCs增殖活性的影响。同时,在功能化微球体外诱导成骨分化能力方面,我们设立MS、MS@SL、MS@SL@BMP-2等实验组,基于ALP、茜素红染色,免疫荧光等实验方法综合评估体外诱导成骨能力。最后,在体内实验方面,我们构建大鼠股骨髁缺损模型,将不同组微球注入缺损部位,考察促成骨能力。通过影像学评估(CT扫描),观察缺损部位新生骨,并定量分析骨量、骨密度、骨小梁厚度等指标。同时在术后4,8周取出标本,行H&E、马松染色等组织学染色。 结果:基于微流控装置,我们成功制备了大小均一、形态规则的BMP-2功能化微球。BMP-2在微球内部均匀分布,能够缓慢而持续释放,为促成骨分化创造条件。体外实验方面,微球具备良好的生物相容性,CCK-8,活/死染色结果提示微球对BMSCs增殖分化能力无明显不利影响,细胞死亡较少。体外成骨实验表明,与单纯多孔微球相比,功能化微球因BMP-2持续释放具有优异的诱导BMSCs成骨分化作用,免疫荧光结果也提示,MS@SL@BMP-2组BMSCs呈现显著成骨相关标记物表达。影像学结果表明,MS@SL@BMP-2组显著促进缺损部位骨组织再生,再生组织结构良好。组织学染色结果也表明,新生组织形成以微球为中心向四周放射的成骨模式。 结论:本研究成功构建了BMP-2功能化可注射多孔微球(MS@SL@BMP-2)。该微球具备良好的生物相容性,在体外显著诱导BMSCs成骨分化。体内实验表明,功能化微球表现出优异的促骨组织再生能力,并促进再生组织重塑。因此,本课题构建BMP-2功能化可注射多孔微球,为骨缺损临床治疗提供新的策略。 ...
应用
目的:构建一种负载聚六亚甲基双胍(PHMB)和血管内皮生长因子(rh VEGF)缓释微球的真皮支架复合材料并对其进行表征。对微球和真皮支架的细胞毒性、促血管生成及抑菌作用进行研究。构建糖尿病大鼠创面模型,并将该复合材料植入糖尿病大鼠创面,观察该材料对糖尿病创面的治疗效果。本研究旨在研究一种新的糖尿病大鼠创面修复材料,为临床上糖尿病创面修复提供一种新的方案。 方法:1、通过复乳法制备载有PHMB和rh VEGF的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微球,将其配置成悬液,滴加到胶原溶液和硫酸软骨素制备成的真皮支架上。2、研究PHMB微球和rh VEGF微球的体外特征,通过扫描电镜观察其形态,进行粒径分析。3、用紫外分光光度计和酶联免疫吸附实验测定PHMB和rh VEGF微球的包封率;随后进行微球的体外缓释实验。4、通过CCK8法检测PHMB和rh VEGF缓释微球的细胞毒性和生物相容性,确定其最佳浓度。通过细胞划痕实验检测微球对细胞增殖和迁移能力的影响。5、测定负载PHMB和rh VEGF微球的真皮支架对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抗菌能力。6、制备糖尿病大鼠全层创面模型,大鼠分成3组,分别为A组:负载PHMB和rh VEGF微球的真皮支架组;B组:空白真皮支架组;C组:空白对照组。7、分别在第0、3、7、14、21天进行大体观察、创面拍照量化创面修复情况。8、分别在第7天、14天取创面标本,进行后续实验。通过HE染色,Masson染色,免疫组织化学染色分析糖尿病大鼠创面愈合过程中的组织与分子生物学变化。 结果:1.成功制备出表面具有部分孔隙结构的圆球形的PHMB和rh VEGF微球,平均粒径分别为4.77μm和9.97μm;扫描电镜显示真皮支架的内部存在大量的网状贯通结构,并且微球紧密的贴附在真皮支架内部。2、PHMB微球包封率为61.20±5.12%;rh VEGF微球包封率为78.69%±1.57%。3、PHMB微球的缓释时间可达22天;rh VEGF微球的缓释时间可达12天。4、采用CCK8法和细胞划痕实验检测微球对于细胞增殖的影响,结果表明微球无细胞毒性,并且具有良好的生物相容性。将1 mg/m L浓度的微球滴加到真皮支架上最能促进成纤维细胞(L929)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖和迁移。5、负载微球的真皮支架对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌均有抑制作用。6、第7天和14天的HE染色和Masson染色结果显示A组糖尿病大鼠的炎性细胞浸润较少,真皮组织形成和胶原沉积明显高于B组和C组。7、第14天的免疫组化结果显示,A组糖尿病大鼠创面中的CD31、Ki-67表达量明显高于B组和C组;C组糖尿病大鼠创面中的IL-6和TNF-α明显高于A组和B组。 结论:负载PHMB和rh VEGF微球的真皮支架是一种可靠的创面修复材料,可以起到抗菌和促血管生成的作用,提高糖尿病大鼠伤口的愈合率,改善伤口愈合质量。 ...
在肠道组织工程的研究中,选择合适的生物材料替代细胞外基质(extracellular matrices,ECMs),构建由肠上皮和具有明确血管结构的血管化基质组织结合形成的三维微结构是实现功能性构造的主要挑战。然而,现存技术由于在培养血管化组织,制备隔室化3D细胞培养载体和分区包封异质细胞方面受到限制,无法实现由多种细胞类型组成的,具有血管系统和精确控制的三维结构的肠粘膜组织模型的构建。针对上述问题,本研究以构建生理相关性肠粘膜体外模型为研究对象,引入具有明确血管结构的血管化基质组织,建立具有完整肠粘膜组织成分的血管化肠粘膜体外模型。具体地,本论文利用由同轴共挤出装置形成的水包水(w/w)液滴为模板制备了尺寸可调控的核-壳结构海藻酸凝胶微球,以该凝胶微球作为区室化3D细胞培养载体,在核心包封成纤维细胞(NIH-3T3)和人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)来模拟血管化基质组织,在壳层包封人结直肠腺癌细胞(Caco-2)来模拟肠上皮组织,进而在核-壳结构海藻酸凝胶微球中形成血管化肠粘膜体外组织模型。 在以w/w液滴为模板制备核-壳结构海藻酸钙3D凝胶微球支架及调控探究部分,通过控制流速,可将w/w液滴的核心直径与液滴直径的比值精确控制在0.27～0.86之间,以满足不同的封装需求。此外,通过表征核-薄壳结构3D凝胶微球支架的内部形貌,证明了支架内部具有明确的隔室化分区。之后,通过比较在普通3D支架和核-薄壳结构凝胶微球3D支架的核心中培养HUVEC的增殖和细胞分布情况,结果表明封装在具有疏松网络结构的核-薄壳结构凝胶微球3D支架核心中的HUVEC增殖更快,并且表现出成簇生长的细胞行为。最后,通过分别在核心和壳层封装HUVEC和Caco-2细胞来验证核-薄壳结构3D凝胶微球支架区室化封装异质细胞的能力。由此得出这种隔室尺寸可控并且能够区室化封装异质细胞的核-壳结构3D凝胶微球支架具有构建用于包封和培养多细胞类器官/组织的多功能生物载体的高潜力。 在核-薄壳结构海藻酸钙3D凝胶微球支架核心中构建血管化基质研究部分,探究了 NIH-3T3和HUVEC以固定的接种密度但不同的比例(0:1、2:1、4:1和8:1)所构建的3D共培养模型的血管化能力。其中,NIH-3T3和HUVEC比例为8:1时,NIH-3T3成功诱导HUVEC表现出出芽,迁移和形成脉管结构等细胞行为,展示了良好的血管化能力和在组织工程中规模化制备血管化微组织并与其他器官特异性细胞整合的巨大潜力。 在构建血管化肠粘膜体外组织模型研究部分,将Caco-2细胞和血管化基质细胞(NIH-3T3:HUVEC 8:1)分区隔室化包封在核-薄壳结构海藻酸钙3D凝胶微球支架的壳层和核心以形成血管化肠粘膜体外组织模型。通过对模型内细胞的活力,增殖,分布,细胞骨架形态,紧密连接蛋白表达和特征性生物标志物的分泌测定,证明了三重共培养模型中发生的细胞间相互作用增强了上皮细胞的增殖和活力,表现出上皮紧密连接蛋白的快速分化和P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多药耐药相关蛋白2(Multidrug Resistance Protein 2,MRP2)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)更高的功能表达,说明了这种血管化肠粘膜体外组织模型可以更准确地代表原生组织微环境,以更可靠的方式测试药物吸收。 ...
随着社会老龄化程度的加深及创伤、运动带来的关节损伤,软骨损伤性疾病的发病率日益增加。由于软骨组织无血管、淋巴及神经,自我恢复能力有限,一旦损伤将很难愈合。软骨组织工程为目前修复软骨损伤提供了一个新思路,其主要内容包括:种子细胞、支架材料和细胞生长因子。马钱子碱(Bru)是中药马钱子中的主要有效成分,能够有效促进软骨细胞增殖。聚己内酯(PCL)具有良好的生物相容性和降解性能,可用来制备软骨支架,但生物活性不足、亲水性较低,因此常与生物活性良好的聚羟基乙酸(PGA)和聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)复合制备成软骨支架。本文以PCL为基体材料,以硫酸马钱子碱(BS)和马钱子碱(Bru)为试验药,制备了PCL/PGA/BS软骨支架、载BruPLGA微球以及PCL/PLGA-Bru微球软骨支架,研究其理化性能和药物释放行为,并进行相关生物学评价。具体实验内容分为以下三个部分: 第一部分,本文采用选择性激光烧结3D打印技术,将PCL和PGA混合制备成多孔软骨支架,并筛选其中最优比例,与药物BS混合制备成载药软骨支架,并对其进行了红外光谱检测(FTIR)和药物释放实验。结果表明,软骨支架中,随着PCL含量的升高,支架的力学性能随之增加,但亲水性降低,当PCL含量为70%,PGA 30%时,支架机械性能最好,故选择该比例(PCL:PGA=7:3)与药物混合,制备不同含药量(1%、2.5%、5%、10%)的载药软骨支架,结果发现前期3 h突释率大(>50%)。因此,制备的PCL/PGA-BS支架成药性不高,其释放的马钱子碱不能达到长效缓释以促进软骨修复的作用。 第二部分,本文通过碱沉淀法制备提纯马钱子碱,采用乳化-溶剂蒸发法制备PLGA-马钱子碱微球,建立了高效液相色谱法(HPLC)用于马钱子碱微球含量和释放度的测定,并进行了方法学考察。以载药量和包封率为考察水平,对影响因素进行单因素考察,并在此基础上结合响应面法(Box-Behnken)选择影响比较大的三个因素(PLGA浓度、PVA浓度、油水比),设计三因素两水平的试验对处方进行优化,最终得到载药量(10.30±0.22)%,包封率(61.80±1.30)%的微球。对微球进行了一系列表征和体外药物释放实验,结果发现所制备的微球形态圆整,有轻微粘连。FTIR、XRD和TGA-DSC等证明了马钱子碱与PLGA之间并不是简单的物理混合,而是以无定形态存在于微球中。马钱子碱微球30d内在磷酸缓冲溶液(PBS)中的累计释放率为90%,具有较好的缓释作用。 最后,根据前两部分实验结果,利用选择性激光烧结技术3D打印制备了PCL/PLGA微球软骨支架,对微球支架进行了表征和生物学测试。结果发现,载药微球支架的力学性能较之空白微球支架有所下降,FTIR、XRD和TGADSC等手段表明激光烧结技术并不会改变支架中药物与材料的物相组成和官能团结构,支架晶型和玻璃化转变温度与粉末无明显区别,说明该打印过程仅为物理变化。释药30 d后,药物释放累积量仅达到22%,遵循Ritger-Peppas模型。本文提取培养并鉴定了兔软骨细胞,在CCK8实验中,载药微球组在48 h和72h对软骨细胞有促增殖效果,微球支架组对软骨细胞无细胞毒性,且微球软骨支架生物相容性良好。 ...
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