应用
烧烫伤是一种常见的损伤类型,是由热力、化学物质、电流或辐射等因素导致皮肤及其深层组织的损伤。严重的烧烫伤不仅造成局部组织损伤,还可能引发全身性反应,如感染、休克和多器官功能障碍。伤口愈合过程中,缺氧和过量的活性氧（reactive oxygen species,ROS）是两大主要挑战。缺氧会延缓细胞增殖和血管生成,而ROS则加剧炎症反应和组织损伤。因此,改善局部供氧和清除ROS成为烧烫伤治疗的关键策略。目前有研究发现,为受损组织进行动态供氧可以更好的实现供氧促进修复。因此,本文针对烧烫伤创面微环境中ROS过度积累及组织缺氧的双重难题,创新性地设计并制备了一种以纳米氧化铈为活性氧清除剂,过氧化钙（CaO2）为释氧剂,羧甲基壳聚糖（carboxymethyl chitosan,CMCS）和海藻酸钠（sodium alginate,SA）混合物为pH响应物的核壳微球SA/CMCS＿@CaO2,该微球兼具ROS清除和动态释氧功能,探究该微球对皮肤创面修复过程中细胞活动的影响,植入动物皮下的组织响应和对烧烫伤模型鼠皮肤的修复。具体研究内容和研究结果如下: （1）SA/CMCS＿@CaO2微球的制备和表征。微球主要由核壳两部分结构,内核是明胶/CaO2微球,承担氧气释放,外壳是SA/CMCS,具有pH响应性,且SA/CMCS中含适量纳米氧化铈。首先分析比较了不同pH条件下空白SA/CMCS的溶胀吸水性能,确定SA/CMCS浓度比为1:1时微球溶胀吸水能力与pH正相关,根据研究,具备在低氧环境下加速释氧的性能。制得SA/CMCS＿@CaO2微球的溶胀、吸水、降解以及释氧性能都与pH正相关,说明微球可以响应环境pH从而控制释氧速率。 （2）体外细胞实验评价SA/CMCS＿@CaO2微球对细胞存活、迁移等的影响。通过将小鼠成纤维细胞L929（L929 mouse fibroblasts,L929）分别种植在载SA/CMCS＿@CaO2微球的水凝胶和空白水凝胶上,比较分析得出,含SA/CMCS＿@CaO2微球的组细胞具有高于80%的细胞存活率,更高的增殖细胞比例和迁移细胞数量,并且ROS阳性细胞的荧光强度无显著增强,说明ROS水平被有效控制,未造成额外的氧化应激。 （3）大鼠皮下埋植实验评价载SA/CMCS＿@CaO2微球的组织相容性。将载SA/CMCS＿@CaO2微球的水凝胶和空白水凝胶植入大鼠皮下,对植入7、14、21天的周围组织进行组织学评价。结果发现两组材料在植入皮下后均会引发一定炎症,但含SA/CMCS＿@CaO2微球的组能更快的完成炎症周期进入后续愈合阶段。CD34染色结果表明,含SA/CMCS＿@CaO2微球组同一时间内生成微血管数量更多,面积越大。CD206和一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,i NOS）结果发现,含SA/CMCS＿@CaO2微球的组M1型（促炎）巨噬细胞更快极化成M2型（抗炎）巨噬细胞。 （4）大鼠烧烫伤缺损模型评价SA/CMCS＿@CaO2微球的在体修复效果。将载SA/CMCS＿@CaO2微球的水凝胶和空白水凝胶作为敷料治疗深Ⅱ度烧烫伤模型鼠的烧伤伤口,大体观察发现同一段时间后,含SA/CMCS＿@CaO2微球的组剩余未修复伤口面积更小。HE、Masson、和CD34染色结果证明,含SA/CMCS＿@CaO2微球的组在14天后胶原沉积情况减轻,皮下组织生长更快更成熟,且同一时间含微球组生成血管更多。 综上所述,本研究采用两次乳化交联法制备了一种具有ROS清除和动态释氧功能的微球,该微球能够响应环境pH值动态调节释氧速率。通过协同释氧和调控ROS水平,该微球显著促进了L929细胞的增殖与迁移,增强了血管生成能力,并诱导M1型（促炎型）巨噬细胞向M2型（抗炎型）巨噬细胞的极化,从而加速了烧烫伤皮肤的修复过程。实验结果表明,该微球在烧烫伤修复中展现出显著的促愈合效果,减少了炎症反应并加速了组织再生。该微球有望成为一种新型的烧烫伤治疗材料,为临床烧烫伤修复提供更高效的治疗策略。 ...
自光学显微镜问世以来,其在微观科学研究中始终发挥着不可替代的作用。然而受限于光学衍射极限,传统光学显微镜无法分辨200 nm以下的微观结构。这是由于传统物镜仅能捕获携带低空间频率信息的传播波,而包含物体精细结构的高频倏逝波因在传播过程中呈指数衰减（衰减长度约数十纳米）,无法到达远场被常规光学系统接收。近年来,微球透镜技术的突破为超分辨成像提供了新思路——当介质微球或超半球固体浸没透镜（SIL）与样品表面接触时,其可将样品近场的倏逝波信息耦合转化为传播波,进而实现突破衍射极限的超分辨成像。然而当前主流的商业微球（如SiO2、聚苯乙烯、BaTiO3等）分别存在折射率低、粒径分布宽或粒径不可调、二次加工性差等缺点,严重制约其实际应用。本研究聚焦高折射率聚合物微球的可控制备及其在SIL中的创新应用,通过微流控制备技术,成功制备了粒径分布窄、粒径可调的聚苯乙烯（PS）微球、以及高折射率且粒径单分散的聚邻苯基苯乙氧基丙烯酸酯(Poly（OPPEA）)微球和聚9,9’-双[4-（2-丙烯酰氧基乙氧基）苯基]芴(Poly（A-BPEF）)微球,并研究了其在超分辨成像中的应用。主要研究内容如下: （1）PS基微球的可控制备与成像性能研究 采用微流控制备技术,以苯乙烯（St,折射率n=1.54）、乙氧化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯（ETPTA）、A-BPEF及光引发剂1173（质量比6:3:1:0.2）混合溶液作为复合分散相,以4 wt%PVA水溶液为连续相,通过调控分散相中高粘度单体A-BPEF含量（3.2-6.3wt%）提升液滴的稳定性,通过调节流速比（Qc/Qd=5:1至11:1,Qd固定为5μL/min,其中Qc为连续相流速,Qd为分散相流速）制备了一系列粒径分布较窄且粒径可调的PS基微球,并探究了其在光学显微镜下的成像性能。实验结果表明,研究发现成像放大倍数与微球粒径呈负相关,随着微球粒径从96μm降至56μm,成像倍率从1.66倍提升至1.90倍。 （2）Poly（OPPEA）高折射微球的形貌调控与成像性能优化 基于高折射率OPPEA单体（n=1.57）,通过优化微流控流速比（Qc/Qd=4.5:1-6.5:1）与紫外固化时间（10-30 min）,实现了粒径可调（79-86μm）且高宽比可控（h/d=0.73-0.83,当微球置于被观测基体表面干燥后,微球顶部距基体表面的距离为h,微球与基材接触处的截面直径为d）的Poly（OPPEA）微球的制备。对其超分辨成像性能的研究发现:当微球直径保持不变时,微球放大倍率随h/d的提升而逐渐增大,当h/d从0.73增至0.83时,成像倍率由3.28倍提升至4.22倍。这是由于高宽比增大增强了光子纳米射流效应,使等效数值孔径提升,成像放大倍数增大。 （3）Poly（A-BPEF）高折射微球的制备与成像性能研究 将高粘度、高折射率的A-BPEF单体（n=1.60）以及光引发剂溶解在二氯甲烷中作为分散相,以PVA水溶液为连续相,通过调节流速比（Qc/Qd=2.5:1-6.5:1）与紫外固化时间（5-15 min）,制备出粒径可调（106-60μm）且h/d更大（h/d=0.94-0.99）的Poly（A-BPEF）微球。并研究了微球在空气中（无溶剂浸没）以及乙醇浸没下的成像性能,结果表明:在空气（n=1.0）中成像时,微球与空气的折射率差较大使得成像放大倍数进一步提高（高达5.29倍）,但伴随散射噪声,信噪比较大;而在乙醇（n=1.36）中成像时,微球与周围介质（乙醇）的折射率变小使成像放大倍数下降,但信噪比提升,成像清晰度显著改善。 ...
应用
伤口愈合是一个复杂且高度协调的生物学过程,而伤口微环境中活性氧(（ROS）过度积累、细菌感染以及长期炎症会严重阻碍伤口的修复过程。水凝胶因其优异的生物相容性、高亲水性、可调的理化性质以及可控的药物递送能力,成为伤口敷料的理想候选者。从材料的选择、交联网络的构建、微纳米材料的复合、分子骨架结构的修饰、生物活性成分的引入等多角度出发,可以赋予水凝胶止血、抗氧化、杀菌抗感染、抗炎等多种生物学功能,所开发的多功能水凝胶在促进复杂性伤口愈合以及多级治疗管理方面展现出重要应用价值。本研究设计并构建了一系列负载塞来昔布明胶微球（CEL@GMs）的多功能水凝胶,并系统评估了其在促进伤口愈合领域的应用潜力。主要研究内容总结如下: （1）CEL@GMs制备与优化。通过优化CEL@GMs的制备工艺,得到最优CEL@GMs的载药量为6.64±0.48%,包封率为88.92±6.06%,平均粒径为92.31±1.38μm,且CEL主要以无定形状态包封于微球内部。体外药物释放实验结果表明,CEL@GMs可以长期持续释放CEL。本研究制备的CEL@GMs解决了难溶性抗炎药物的递送问题,其高效药物负载能力与长效药物释放效果,有利于减少给药频次。 （2）GPB水凝胶制备与表征。将不同含量的CEL@GMs与明胶（Gel）、原儿茶醛（PA）和偏硼酸钠（Na BO2）物理混合,开发了一系列双动态交联的多功能水凝胶（GPB）。该水凝胶凝胶化时间短,含水量高,具有良好的溶胀特性以及优异的力学性能。经优化筛选,确定GPB-2水凝胶（CEL@GMs含量为10 mg/m L）为最优处方。PA的邻苯二酚结构使GPB-2水凝胶具有类似贻贝的粘附特性,其粘附强度达11.1±1.7 k Pa,席夫碱键和硼酸酯键赋予该水凝胶优良的自修复能力。 （3）GPB水凝胶多功能性考察。GPB-2水凝胶兼具止血、ROS清除和抗感染等多种功能。该水凝胶表现出良好的生物相容性,在60 s内实现了快速凝血,大鼠断尾出血模型下GPB-2水凝胶组出血量仅为0.43±0.13 g。GPB-2水凝胶的DPPH清除率达到72.51±2.02%,ABTS清除率高达90.28±0.24%,对Fe2+螯合活性为59.95±0.35%,表现出较强的抗氧化能力,并且该水凝胶可以通过破坏细菌细胞膜,抑制大肠杆菌（E.coli）和金黄色葡萄球菌（S.aureus）的生长。 （4）GPB水凝胶促进伤口愈合评价。全层皮肤缺损模型愈合情况以及H&E染色和Masson三色染色结果表明,CEL@GMs掺入的GPB-2水凝胶可以促进伤口部位毛囊的再生,加速伤口再上皮化过程,增加胶原蛋白的沉积,有效促进伤口愈合。 本研究成功构建的负载微球的明胶基水凝胶,具有制备工艺简单,制剂性质稳定,安全有效的优势,为促进伤口愈合提供了一种有效的制剂形式,在临床上具有潜在应用价值。 ...
骨髓抑制是肿瘤放化疗过程中伴随发生的常见不良反应,会导致骨髓造血功能降低,白细胞、红细胞和血小板数量减少,免疫力下降、贫血和易出血等严重的健康问题,影响临床效果和生存质量,在肿瘤治疗领域受到广泛关注。烟酰胺单核苷酸（Nicotinamide Mononucleotide,NMN）是一种内源性核苷酸,具有广泛的生理活性,尤其对血液衰竭的重建和恢复显示有治疗潜力,其对于化疗/放疗所致骨髓抑制而产生的造血功能损伤的防护效应及分子机制尚不明确。与此同时,NMN的应用面临系统生物利用度低、给药频繁、使用周期长且易受食物影响的挑战。 有鉴于此,本论文首先基于真实世界数据对药物所致的不良反应/事件进行全面探讨,重点分析化疗药物在治疗过程中发生机率最大、且较为严重的不良反应/事件,在此基础上构建动物模型,探究NMN对化疗/放疗所致发生率较高的不良反应/事件的防护效应及分子机制;设计具有高生物利用度和缓释作用的微球递送系统NMN微球（NMN-microspheres,NMN-MS）,优化制备工艺,评价其对化疗/放疗所致该不良反应/事件的防护效应。研究结果有助于推动NMN在骨髓造血功能损伤治疗中的临床应用,促进NMN制剂的研发与革新,同时为肿瘤放疗后骨髓抑制防护制剂的开发提供新思路。论文研究围绕以下五个方面开展。 1.药品不良反应/事件分析 基于某医院近7年的药品不良反应/事件数据,重点分析化疗药物在抗肿瘤治疗中的不良反应发生情况。通过对209例不良反应/事件报告的分析,发现非小细胞肺癌、结肠癌及直肠癌患者的不良反应发生率较高,其中铂类药物引发的不良反应占比最高（32%）,且以发热性中性粒细胞减少、白细胞计数减少、中性粒细胞计数减少及血小板计数减少等骨髓抑制表现为主;奥沙利铂、顺铂、紫杉醇及卡培他滨等化疗药物是引发严重不良反应的主要品类,尤其是骨髓抑制现象最为常见。研究结果表明骨髓抑制是奥沙利铂、顺铂等药物化疗过程中最常见且发生率最高的不良反应,为后续NMN在化疗所致骨髓抑制的防护效应研究设计提供了科学依据。 2.NMN对化疗/放疗致骨髓抑制的防护效应与分子机制 研究构建顺铂和射线辐照诱导小鼠骨髓抑制模型,在此基础上探讨NMN对造血功能损伤的防护作用及其分子机制。结果表明,顺铂和射线辐照均能成功诱导小鼠产生骨髓抑制,与Model组相比,NMN处理能够有效改善模型小鼠的外周血细胞计数、骨髓有核细胞（Bone marrow nucleated cells,BMNC）和造血干细胞（Hematopoietic stem cell,HSC）降低,促进造血因子分泌,降低股骨损伤,对于骨髓抑制所致造血功能损伤发挥显著的防护作用。生物信息学分析和分子生物学实验验证研究表明,NMN可显著上调p-PI3K、p-AKT蛋白及m RNA的表达,并增加Bcl-2蛋白水平,通过激活PI3K/AKT/Bcl-2通路,抑制HSC的降低,从而实现对骨髓抑制所致造血功能损伤的有效防护。 3.NMN-MS制备、表征及药动学研究 以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly（lactic-co-glycolic acid）,PLGA)为载体,采用水包油包固（Solid-in-oil-in-water,S/O/W）乳化溶剂挥发法制备NMN-MS,通过单因素和正交试验进行处方和工艺优化,获得最优微球制备条件为PLGA 5050 2E、PLGA浓度100 mg/mL、油水比1:10。表征结果显示,所制备的微球表面光滑,形态完整,粒径～120μm,分布均匀,载药量～6%,包封率>50%。体外释放实验表明,微球在12 d内的药物释放率>90%,释放机制以扩散为主。以NMN原料药静脉注射为对照的大鼠药动学研究发现,NMN-MS皮下注射的生物利用度为114.74±3.37%,显著高于NMN的口服生物利用度（75.56±9.18%,p<0.01）;平均滞留时间(Mean residence time,MRT0-∞)、半衰期(Half-life,t1/2)分别为297.56±126.60 h和240.18±116.02 h,也显著高于口服NMN（p<0.05）,结果表明NMN-MS皮下注射是适于NMN体内给药的理想药物递送形式。 4.NMN-MS对顺铂致小鼠骨髓抑制的防护效应研究 基于小鼠模型研究NMN-MS对顺铂诱导的骨髓抑制后造血功能损伤的保护作用。结果表明,NMN-MS能显著抑制顺铂导致的外周血细胞(白细胞:3.69±0.59×10～9/L,红细胞:10.26±0.79×1012/L,血红蛋白:141.4±9.09 g/L,血小板:1223.90±149.91×1012/L)和BMNC（5.49±0.38×10～6）的降低,促进多个造血因子分泌;在不显著影响BMNC周期的同时有效抑制BMNC凋亡,凋亡率为8.96%,并提高HSC水平（CD34+2.34%）。病理染色结果显示NMN-MS可减轻股骨损伤,降低氧化应激因子,无炎症反应,且胸腺和脾指数,脾免疫球蛋白G（Immunoglobulin G,Ig G）,CD4+T细胞,CD8+T细胞,CD4+/CD8+T细胞在淋巴细胞中百分率也显著提升,从而增强免疫。这些结果表明NMN-MS对化疗致骨髓抑制后的造血功能损伤、炎症反应、氧化应激及免疫功能具有显著的防护效果。 5.NMN-MS对射线辐照致小鼠骨髓抑制的防护效应研究 基于小鼠模型研究NMN-MS对射线辐照诱导的骨髓抑制后造血功能损伤的保护作用。结果表明,NMN-MS能显著抑制X射线辐照导致的外周血细胞(红细胞:（9.64±0.36）×1012/L,血红蛋白:131.60±6.02 g/L,血小板:（583.20±28.54）×1012/L)和BMNC（1.94±0.21×10～6）的降低,促进多个造血因子分泌;在不显著影响BMNC周期的同时有效抑制BMNC凋亡,凋亡率为7.51%,并提高HSC水平（CD34+2.41%）。此外,病理染色结果显示NMN-MS可减轻股骨损伤,降低炎症及氧化应激因子,且胸腺和脾指数,脾Ig G,CD4+T细胞,CD8+T细胞,CD4+/CD8+T细胞在淋巴细胞中百分率也显著提升,从而增强免疫。这些结果表明NMN-MS对放疗致骨髓抑制后的造血功能损伤、炎症反应、氧化应激及免疫功能具有显著的防护效果。 综上所述,本论文基于药品不良反应/事件的真实世界数据分析揭示了肿瘤治疗中骨髓抑制的高发性及其临床挑战,探索了NMN对化疗/放疗致骨髓抑制的防护作用和分子机制,研制了具有高生物利用度和良好释药性能的缓释微球载药系统NMN-MS,并系统评价了其对化疗/放疗致骨髓抑制的防护潜力,为推进NMN的开发应用提供了科学依据和创新思路。 ...
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